亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与冠心病患者冠状动脉病变及叶酸水平相关性研究

李 垚，陈万林，杨 平，左宝功

(1.陕西省宝鸡市人民医院心血管内一科，陕西 宝鸡 721000；2.陕西省千阳县人民医院心内科，陕西 宝鸡 721100)

冠心病即冠状动脉粥样硬化性心脏病，是患者冠状血管动脉出现动脉粥样硬化导致血管变窄、阻塞引起心肌缺氧或缺血性坏死的一种心脏病[1]。出现冠心病的人群以中老年居多，此外高血压、糖尿病患者或过度肥胖的人群也存在较大的患病风险。冠心病患者病情严重时，存在猝死的风险，对患者生命安全存在严重威胁。一般冠心病的产生与患者胆固醇过高、季节变化、情绪激动、体力活动增加、饱食、大量吸烟和饮酒等因素有关[2]。随着临床基因研究的逐渐深入发现血浆同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)与冠心病产生之间存在着明显的关系，因此亚甲基四氢叶酸还原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因作为Hcy的关键代谢酶受到了临床医疗团队的广泛关注[3]。本研究对98例冠心病患者的MTHFR C677T多态性的特点与其冠状动脉病变情况及叶酸水平之间的关系进行分析，进一步对冠心病患者的发病相关机制进行研究，为临床预防和治疗冠心病患者提供借鉴资料。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入受检者为2018年12月至2020年6 月在我院接受检查或治疗的98例冠心病患者和同期的35例正常受检者，冠心病组中有男性患者54例，女性患者44例，年龄45～62岁，平均(51.44±3.21)岁。经冠状动脉造影判断患者冠状动脉病变情况分布为：冠状动脉单支病变35例，冠状动脉双支病变34例，冠状动脉三支病变29例。患者冠心病分型情况为：稳定型心绞痛27例，不稳定型心绞痛22例，急性心肌梗死25例，缺血性心肌病24例。正常组有男性19例，女性16例，年龄42～65岁，平均(52..37±4.32)岁。两组受检者除疾病信息外的基础资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。病例纳入标准：①冠心病组患者均符合冠心病的诊断标准；②所有受检者均同意配合本研究相关检查及标本取样，并已经签署知情同意书；③本研究经医院伦理委员会审核同意并在其监督下执行。排除标准：①冠心病组患者除冠心病外还存在其他可能影响试验结果的心血管相关疾病；②两组受检者存在肝、肾功能障碍或免疫机制障碍；③受检者患有恶性肿瘤疾病或结缔组织慢性疾病；④患者此前服用过可能对叶酸等其他试验指标产生影响的相关药物或接受过相关治疗。

1.2 研究方法

1.2.1 MTHFR C677T基因多态性检测：在清晨分别抽取受检者5 ml空腹静脉血并将其置于抗凝试管中，使用离心机以3000 r/min的速度离心15 min后弃上清采用盐析法对下层血细胞进行DNA提取。使用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性获得MTHFR C677T基因分型。使用PCR扩增仪进行反应，PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min，34个循环扩增(94 ℃ 45 s，61.5 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s)，72 ℃延伸7 min。反应结束后取2%的琼脂糖凝胶5l进行电泳，对PCR产物扩增情况进行观察并详细记录，在相应位置如果发现清晰的扩增条带则进行酶切反应。将5l PCR产物并向其中加入5 U限制性内切酶HINFⅠ在37 ℃环境下水浴酶切4 h。将酶切产物使用3%的琼脂糖凝胶进行电泳并使用电泳成像系统进行观察并记录相关数据(图1)。

1.2.2 血浆Hcy检测：按照相同方式抽取3 ml空腹静脉血后将其置于抗凝试管中，在4 ℃环境下以3000 r/min的速度离心5 min后留取上层血浆在-70 ℃存放等待检测。使用同型半氨酸试剂盒在带有荧光检测器的高压液相层析仪系统中采用速率法进行检测。

图1 MTHFR C677T多态性电泳图

1.3 观察指标 ①对冠心病患者和正常受检者的MTHFR C677T基因型及等位基因频率分布情况进行对比。②对不同病变程度冠心病患者叶酸水平及MTHFR C677T基因型频率分布情况差异进行对比。③对不同MTHFR C677T基因型中Hcy水平分布情况进行对比。

2 结 果

2.1 两组受检者MTHFR C677T基因型、等位基因频率分布及Hcy水平比较 两组受检者MTHFR C677T基因型及等位基因频率分布比较差异无有统计学意义(P>0.05)，冠心病组患者Hcy水平显著高于正常组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 不同病变程度冠心病患者叶酸水平及MTHFR C677T基因型分布比较 从受检患者MTHFR C677T基因型分布情况来看，随着患者冠状动脉病变情况的程度加深患者TT及TC基因型频率分布和患者Hcy水平逐渐增加，CC基因型频率分布逐渐下降，TC、CC基因型和Hcy水平组间对比差异具有统计学意义(P<0.05)，TT基因型频率分布组间对比差异不具有统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 两组受检者MTHFR C677T基因型、等位基因频率分布以及Hcy水平的差异

表2 不同病变程度冠心病患者Hcy水平及MTHFR C677T基因型分布比较

2.3 不同MTHFR C677T基因型中Hcy水平分布 从MTHFR C677T基因型与Hcy水平的关系来看，TT、TC基因个体的Hcy水平均较CC基因个体高，组间对比差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同MTHFR C677T基因型Hcy水平分布

3 讨 论

冠心病是临床上较为常见的心血管疾病之一，又被称之为冠状动脉粥样硬化心脏疾病，冠心病主要是指疾病的发生发展以及多个不同因素所致，像常见的血液脂质代谢紊乱，甚至患者的血液中存在部分脂质粘附在人体的血管壁上，进而导致患者发生心肌缺血以及供氧不足等情况，最终致使患者发生心肌坏死[4-5]。冠心病作为心血管疾病的一种是非传染性疾病中具有较高病死率的疾病，是导致临床患者病死率上升的主要原因之一[6]。Hcy是人体进行多种生化反应过程中产生的一种非必需氨基酸，它主要是通过激活的甲硫氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸进而水解生成叶酸，当人体内Hcy水平上升也就说明其叶酸浓度变低[7]。叶酸在人体中通过甲基化过程参与到蛋氨酸的循环之中，进入机体的叶酸在二氢叶酸还原酶作用下转变为二氢叶酸，之后进一步转化为四氢叶酸；在丝氨酸羟甲基转移酶的作用下，四氢叶酸活化为5，10-亚甲基四氢叶酸，这个反应过程是具有可逆性的；在亚甲基四氢叶酸还原酶的作用下，5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸；同型半胱氨酸、维生素B12，在蛋氨酸合成酶作用下，5-甲基四氢叶酸为其提供甲基，合成蛋氨酸，而在这个环节中MTHFR是关键性的调控酶[8-9]。叶酸在人体多种生活反应中参与并起着重要作用，它能够促进嘌呤和嘧啶的合成以及参与DNA和RNA与蛋白质的甲基化过程进而对DNA的代谢产生影响。既往在医学领域公认的冠心病独立危险因素只有高血压、高血脂、糖尿病以及吸烟、肥胖等个人因素，但是随着临床研究的不断深入，临床上有许多研究都指出叶酸水平的变化与冠心病存在密切的相关性[10-11]。这主要是因为Hcy产生的超氧化物和过氧化物可导致血管内皮细胞损伤和低密度脂蛋白氧化，造成血管平滑肌的持续性收缩以及缺氧，从而加速动脉粥样硬化的过程，因而叶酸水平的检测已经成为冠心病诊断的重要指标[12]。同时还提示患者存在患有其他与动脉粥样硬化相关的血管病、脑卒中、类风湿性关节炎、多种癌症等疾病[13-15]，提示临床治疗中能够通过指导患病高风险人群饮食或增加摄入B族维生素及叶酸，降低血浆中同型半胱氨酸水平，从而减少心、脑血管病的患病危险性，对于心脑血管患者而言也能通过这种方式缓解症状，控制病情进展。

本研究中显示从数据上看冠心病患者的MTHFR C677T基因型及等位基因频率分布以及血清Hcy水平均明显高于正常人群，可见两者与冠心病患者的发病危险性存在着明显的关系，同时提示临床研究中可将其作为冠心病诊断方式之一。既往临床经验提示与叶酸浓度变化相关的冠心病患者在临床上占据绝大部分，也都是导致冠心病患者死亡的重要原因之一，这主要是因为人体内叶酸浓度过低，Hcy在人体中浓度及水平上升进而影响血管内皮细胞，对其造成损伤进而导致动脉血管硬化或形成粥样斑块进而引起冠心病等心脑血管疾病的形成。张恩科等[13]对近年来MTHFR基因多态性的研究进行回顾分析发现其与高血脂症的产生存在明显的关系，同时指出其与心脑血管疾病产生的相关危险因素关系密切，符合本研究结果。从冠心病患者病变情况与患者MTHFR C677T基因型频率分布以及血清Hcy水平的情况来看，随着患者冠状动脉病变的发展其TT及TC基因型呈现增加的趋势，患者的血清Hcy水平也明显增加，而CC基因型分布则呈现较为明显的下降趋势。这说明Hcy水平与MTHFR C677T基因型分布情况与冠心病病情发展之间均存在明显的关系。单独分析MTHFR C677T基因型与血清Hcy水平的关系可以发现携带T型基因的患者个体明显血清Hcy水平更高，因而可以猜测Hcy水平的上升应该与等位基因T之间存在者明显的关系。舒放等[14]同样指出Hcy水平的上升与MTHFR C677T基因T存在明显关系，但其在研究中还指出男性患者缺乏叶酸者更容易产生高Hcy血症。本研究中纳入的患者男女人数差异较小，未能发现性别与患者患病风险之间的显著差异性，同时也提示在之后的研究中应该进一步丰富相关资料对患病风险的影响因素深入分析。

综上所述，MTHFR C677T基因多态性与Hcy水平以及冠心病患者发病风险之间存在明显的关系，患者血清Hcy水平上升以及MTHFR C677T基因型多态性尤其是携带T基因型的患者具有较高的冠心病患病风险，同时MTHFR C677T基因型多态性还与冠心病患者的病情进展存在一定联系，能够对冠心病患者的病情进展状况进行判断增加了临床针对性治疗和患者疗效评价的有效参考指标。但是本研究中仍然存在问题与不足，此次研究纳入样本数量较少，难以体现不同基因型之间的分布差异，后续研究中应当增加研究对象标本数量完善研究结果，提高研究结果的有效性。