狄斯瓦螨对意大利蜜蜂工蜂呼吸代谢的影响

谭 静, 武江利, 涂洋洋, Tessema AYNALEM,2, 于慧敏,李南南, 李小英, 徐书法，*

(1. 中国农业科学院蜜蜂研究所, 农业农村部授粉昆虫生物学重点实验室, 北京 100093;2. College of Agriculture and Environmental Science, Bahir Dar University, P. O. Box 5501, Bahir Dar, Ethiopia)

意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(简称“意蜂”)是一种重要的经济昆虫，不仅为人类提供多种绿色健康的蜂产品，而且作为重要的授粉昆虫，每年为全球价值2 150亿美元的农作物进行授粉(Brittain and Potts, 2010; Gilletal., 2012; Smithetal., 2013)。近年来，全球出现的蜂群损失现象使养蜂业和依赖蜜蜂授粉的种植业受到严重威胁(Piouetal., 2019)。狄斯瓦螨Varroadestructor隶属节肢动物门(Arthropoda)蜱螨亚纲(Acari)寄螨总目(Parasitiformes)瓦螨科(Varroidae)(Anderson and Trueman, 2000)，是威胁蜜蜂健康最为严重的致病因子，不仅可通过寄生在蜜蜂身体上消耗脂肪体来损害蜜蜂健康(Ramseyetal., 2019)，还可通过携播病毒的方式，影响蜜蜂新陈代谢、抑制免疫及缩短寿命(Annosciaetal., 2012; Nazzietal., 2012)。

呼吸代谢是一切生命活动的基础，通过研究昆虫呼吸代谢的变化规律，对于分析其对环境的适应性、了解代谢底物的利用情况以及评价昆虫机体的生理状态具有重要意义(Slamaetal., 2007; DeVries and Appel, 2013; 王冬梅等, 2014; DeVriesetal., 2015)。蜜蜂作为一种完全变态的社会性昆虫，在不同的条件下，其呼吸代谢存在不同的变化特征。Allen(1959)研究发现，出房18 h后的工蜂随日龄增加呼吸代谢不断升高，在2日龄时工蜂呼吸率最低；Jungmann等(1989)采用瓦氏微量呼吸仪和气体分析仪分析发现，蜜蜂在静止状态下的呼吸率显著高于飞行状态；夏邦颖和郭郛(1965)利用瓦氏微量呼吸仪分析发现，生殖型个体(蜂王和雄蜂)的呼吸代谢高于非生殖型个体(工蜂)；缪晓青等(2001)利用DKW-3型微量呼吸检压仪研究发现，意蜂工蜂蛹期呼吸商(respiratory quotient, RQ)明显高于中华蜜蜂Apisceranacerana；卢宜娟等(2008)利用华勃式微量呼吸检压仪测定发现，中华蜜蜂和意大利蜜蜂受精卵在不同发育时间其耗氧量存在明显差异，可能与受精卵内在发育机制的调控相关。目前，影响蜜蜂呼吸代谢的因素的研究多集中在温度、种类、日龄、行为等方面，而关于在寄生虫等生物危害因子对蜜蜂呼吸代谢的影响方面研究较少，尤其是狄斯瓦螨这一重要的全球性蜜蜂寄生虫对宿主呼吸代谢的影响未见报道。本研究通过测定狄斯瓦螨侵染不同发育时期意蜂的耗氧量、CO2释放量和呼吸商，分析染螨后意蜂成蜂呼吸相关基因的表达量变化规律，以期明确在狄斯瓦螨侵染下意蜂呼吸代谢的变化规律，为今后深入研究狄斯瓦螨与意蜂之间的相互作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 意蜂虫源及处理

实验材料于2019年8月取自中国农业科学院蜜蜂研究所蜂场。实验分为染螨组和对照组，每组分为3个重复。染螨组：选取3群群势大小一致(同种同日龄蜂王，健康蜂群)的蜂群，通过限王产卵的方法，在蜂王产卵后将其移出。实验中，为获得准确日龄的实验用蜂，我们对相同日龄的幼虫、蛹在巢框上标记，对新出房成蜂进行蜂体标记。狄斯瓦螨取自中国农业科学院蜜蜂研究所染螨实验蜂群，参考Dietemann等(2013)的方法，于幼虫封盖前1 d接螨(每蜂群1头)，放入健康蜂群中进行标记、观察。对意蜂工蜂4日龄幼虫、5日龄蛹、新出房成蜂、出房后第6日成蜂分别采样，其中染螨组以观察到意蜂体有螨寄生时取样。对照组：选取3群群势大小一致的不接螨健康蜂群作为对照，实验方法及标记方法与染螨组相同。

1.2 意蜂呼吸代谢指标的测定

选取4个发育时期(4日龄幼虫、5日龄蛹、新出房成蜂和出房后6日龄成蜂)意蜂工蜂放入SSI多通道昆虫呼吸仪(Sable System International Inc.)的呼吸室内(图1)，恒温水箱温度控制在34.5±0.05℃。呼吸室的连接处均涂有油性物质，以保证呼吸室的密闭性，用CaSO4干燥剂除去从空气中进入到多通道昆虫中呼吸仪的水。调整进气流速为90 mL/min，待整个测量装置稳定后，将待测意蜂放入呼吸室测量，每头蜜蜂测试时间为3 min，数据通过ExpeData程序软件进行储存和分析。样本均实行单头测试，第一通道为空白管，用于校准基线。每个时期重复5次，每次测量7头蜜蜂。

图1 SSI多通道蜜蜂呼吸测定示意图

1.3 呼吸代谢相关基因表达量的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定

用Trizol(Invitrogen产品)分别提取6日龄染螨成年工蜂和健康成年工蜂的RNA，随后按照第1链合成试剂盒HiFiScirpt cDNA(康为世纪)的操作说明进行cDNA第1链的合成。采用Primer Premier 5.0 设计特异性引物，分别设计5个呼吸相关基因的RT-qPCR引物(表1)，以β-actin作为内参基因。根据SYBR FAST qPCR Kit(KAPA Biosystems, KK4601)的说明配制反应体系，每个样本设3个重复。反应条件： 95℃ 5 min; 95℃ 3 s, 60℃ 30 s, 40个循环；熔解程序： 95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 95℃ 15 s, 每0.6℃进行 1 次荧光监测。利用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。

表1 RT-qPCR所用引物信息

1.4 数据处理

使用单因素方差(ANOVA)分析不同时期染螨意蜂和健康意蜂耗氧量(mL/min)、CO2释放量(mL/min)和呼吸商变化，Duncan氏多重比较分析差异显著性(P<0.05)。利用独立样本t检验分析染螨成蜂与健康成蜂耗氧量、CO2释放量和呼吸商以及呼吸相关基因表达量的差异显著性(P<0.05)。采用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理。

2 结果

2.1 染螨意蜂与健康意蜂工蜂耗氧量的比较分析

染螨意蜂与健康意蜂工蜂个体平均耗氧量如图2所示。结果表明，在4日龄时，染螨意蜂与健康意蜂幼虫期耗氧量一致，均为0.0095 mL/min。健康意蜂耗氧量从4日龄幼虫至出房后6日龄成蜂呈逐渐上升趋势，至6日龄成蜂时耗氧量达最大，为0.0344 mL/min，显著高于其他时期的耗氧量(P<0.05)。与健康意蜂不同，染螨意蜂工蜂耗氧量变化曲线为先升后降，其中5日龄蛹期耗氧量最高，达0.0244 mL/min，显著高于4日龄幼虫、新出房成蜂和出房后6日龄成蜂的耗氧量(P<0.05)；随后染螨新出房意蜂耗氧量迅速降低，至6日龄成蜂时耗氧量最低，为0.0093 mL/min，极显著低于健康意蜂同日龄成蜂耗氧量(P<0.01)。

图2 狄斯瓦螨感染的与健康的不同发育时期意蜂工蜂耗氧量的差异

2.2 染螨意蜂与健康意蜂工蜂CO2释放量的比较分析

由图3可知，健康意蜂CO2释放量从4日龄幼虫至6日龄成蜂呈逐渐上升趋势，至6日龄成蜂时CO2释放量达最大，为0.0316 mL/min，显著高于其他时期CO2释放量(P<0.05)。与健康意蜂不同，染螨意蜂CO2释放量变化特征为先升后降，5日龄蛹期CO2释放量最高，达0.0174 mL/min，显著高于4日龄幼虫、新出房成蜂和6日龄成蜂时期的CO2释放量(P<0.05)；染螨意蜂的CO2释放量以5日龄蛹期为拐点，5日龄蛹期至新出房成蜂的CO2释放量迅速降低，低至0.0053 mL/min，极显著低于同龄期健康意蜂CO2释放量(P<0.01)；新出房成蜂与6日龄成蜂期比较，染螨意蜂CO2释放量变化曲线下降较小，差异不显著(P>0.05)。 与健康意蜂相比，染螨意蜂6日龄成蜂CO2释放量极显著降低(P<0.01)。

图3 狄斯瓦螨感染的与健康的不同发育时期意蜂工蜂CO2释放量的差异

2.3 染螨意蜂与健康意蜂工蜂呼吸商的比较分析

呼吸商(RQ)是CO2的释放量和O2消耗量的比值，常用来判断呼吸底物性质的指标。由表2可知，随着意蜂的发育，健康意蜂呼吸商没有明显变化，总体呈平缓上升趋势，虽然6日龄成蜂时呼吸商达最高，为0.9169，但与其他发育阶段的呼吸商相比，差异不显著(P>0.05)。与健康意蜂相比，染螨意蜂呼吸商呈下降变化趋势，尤其是成蜂时期，呼吸商低于0.6，显著低于健康意蜂(P<0.05)。

表2 狄斯瓦螨感染的与健康的不同发育时期意蜂工蜂的呼吸商

图4 狄斯瓦螨感染的与健康意蜂成年工蜂呼吸代谢相关基因的相对表达量

2.4 狄斯瓦螨感染后意蜂成年工蜂呼吸代谢相关基因的表达分析

染螨成年工蜂与健康成年工蜂中Coq7,COXⅠ,CytB,CytC和IF-2mt基因的相对表达量见图4。结果发现，染螨成年工蜂中Coq7,COXⅠ,CytB,CytC和IF-2mt基因的表达量均高于健康成年工蜂，且CytB和CytC的相对表达量分别是健康成年工蜂的1.7676和1.9929倍，差异达显著水平(P<0.05)。

3 讨论

昆虫耗氧量、CO2释放量的测定是研究其呼吸代谢功能的一种重要指标。狄斯瓦螨作为全世界意蜂蜂群最具毁灭性的害虫之一，严重影响着意蜂生长、发育和代谢强度(秦瑶等, 2018)。研究表明，昆虫在适宜环境内呼吸代谢平稳，处于最协调状态；当受到外界压力刺激时，呼吸代谢则出现大幅度变化，昆虫可通过一系列生理活动(早熟化蛹)、生化反应(呼吸商变化、ATP变化等)或相应的应激反应来自我调节以适应外界压力(Addo-Bediakoetal., 2002; Martinezetal., 2017)。本研究结果发现，意蜂受狄斯瓦螨侵染后，其耗氧量、CO2释放量呈先升后降趋势，其中耗氧量从5日龄蛹期的0.0244 mL/min下降至6日龄成蜂期的0.0093 mL/min，CO2释放量从5日龄蛹期的0.0174 mL/min下降至6日龄成蜂期的0.0040 mL/min，在整个变化中可明显看到一个拐点期，即意蜂5日龄蛹期的耗氧量和CO2释放量达到最高，显著高于健康意蜂(图2和3)。这可能与狄斯瓦螨入侵宿主蛹期后导致其机体出现增强呼吸代谢的自我调节有关，由于狄斯瓦螨通常寄生于意蜂蛹发育时期，该时期最大的特点是面对外界生物侵袭时防御能力较低，此时期的蛹不需要摄取外界食物，因此蛹期的耗氧量和CO2释放量达到最高，随后随着狄斯瓦螨侵染，意蜂呼吸代谢大幅下降。尽管不同外界因素对蜜蜂呼吸代谢影响的研究较多(Jungmannetal., 1989; 缪晓青等, 2001; 卢宜娟等, 2010)，但未见涉及有害生物因子如寄生虫等对蜜蜂呼吸代谢影响的报道，本研究首次分析了受狄斯瓦螨侵染后意蜂呼吸代谢的变化规律，对今后指导蜂螨防治具有重要意义。

呼吸商作为判断昆虫代谢底物类型的重要指标，可直观反映昆虫在不同发育时期、不同环境状态下所消耗的代谢底物种类。本研究发现，健康意蜂4日龄幼虫呼吸商为0.8540，5日龄蛹呼吸商为0.7837，6日龄成蜂呼吸商为0.9169(表2)。前人研究发现，昆虫的呼吸商可反映出代谢底物类型，呼吸商在0.71时，呼吸代谢底物为脂类，呼吸商在0.8时，呼吸代谢底物为蛋白质，呼吸商在1.0时，呼吸代谢底物为碳水化合物(吴坤君等, 1989)，根据前人的研究结果，可以推测正常发育意蜂幼虫期呼吸代谢底物主要为蛋白质，蛹期主要为脂类，成蜂期主要为碳水化合物。这种推论与意蜂生长发育时的食物供给相一致。而受狄斯瓦螨侵染后，意蜂呼吸商剧烈下降，从5日龄蛹期的呼吸商0.7049下降至6日龄成蜂期的0.4424，显著低于健康意蜂(表2)，这可能与意蜂受到外界胁迫后，可通过调节呼吸代谢水平的强弱、调整代谢底物的类型等方式来提高其对环境胁迫的适应能力有关。但随着狄斯瓦螨侵染，一方面可促使DWV等病毒显著增殖，导致意蜂体液免疫和细胞免疫等代谢水平发生紊乱，另一方面意蜂代谢底物的大量消耗及有毒代谢物的积累，可严重破坏意蜂正常代谢途径，从而影响意蜂正常的生理生化代谢，这与Hatjina等(2013)、DeVries等(2015)、钱雪等(2016)、何立志等(2017)和闫蒙云等(2018)的研究结果相近，认为当受温度、饥饿、杀虫剂等因素胁迫下，昆虫可通过改变代谢底物的类型来增强机体对不良因子的抵抗力。

研究表明，同一物种不同品种、相同品种不同状态下的昆虫其呼吸商也存在较大差异。Jungmann等(1989)研究表明，低温下(Ta=10℃)休息的成蜂呼吸商为1.01，与高温下(12.5℃≤Ta≤35℃)活动的成蜂呼吸商差异不显著，长时间飞行的蜜蜂呼吸商显著小于1.00。缪晓青等(2001)研究发现，中蜂工蜂蛹期呼吸商为0.798，意蜂工蜂蛹期呼吸商为0.846。卢宜娟等(2010)研究表明，中华蜜蜂幼虫期呼吸商为0.838，意大利蜜蜂幼虫期为0.870，中华蜜蜂蛹期呼吸商为0.760，意大利蜜蜂蛹期为0.770。与缪晓青(2001)和卢宜娟(2010)的研究比较发现，中华蜜蜂幼虫期和蛹期的呼吸商均低于意蜂，动态范围在0.7～0.9之间，染螨意蜂呼吸商均明显低于健康意蜂呼吸商，染螨后呼吸商急剧下降低于0.5。因此，蜜蜂呼吸商低于0.5时，可作为科学评价其受外界危害程度的一个阈值。本实验对染螨条件下参与意蜂呼吸代谢的5个侯选基因(Coq7,COXⅠ,CytB,CytC和IF-2mt)的表达特性进行了初步研究。其中Coq7(也称为mclk-1)是一种羟化酶(coq7p)，参与辅酶(CoQ)合成途径的最后一步(Acostaetal., 2016)；核编码线粒体翻译起始因子2(IF-2mt)，是线粒体蛋白质合成的一种关键调节酶；线粒体编码的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)，是细胞色素C氧化酶(复合物Ⅳ)的催化亚单位之一，呼吸链的末端酶，可将电子从CytC上转移到O2(Coronaetal., 2005)。细胞色素C存在于线粒体内膜上，作为呼吸链的重要一员，影响ATP的产生。细胞色素B(CytB)、细胞色素C(CytC)为生命体内氧化还原链上重要的电子传递体，在哺乳动物细胞中，细胞色素C从线粒体释放到胞质中是起始凋亡途径的关键一步，被认为是线粒体凋亡途径的重要标志(Liuetal., 2007)。本研究发现，受狄斯瓦螨侵染后，意蜂成年工蜂中与呼吸相关侯选基因的表达量均高于健康成蜂(图4)，这与前人的报道(Navarroetal., 2002)相似。意蜂从蛹期至成蜂期呼吸商降低，其与呼吸相关基因的表达却明显提高，其中CytB和CytC基因在染螨前后表达差异显著(图4)，推测受狄斯瓦螨侵染后，意蜂机体呼吸代谢受到较大影响，初期可通过调节呼吸和消耗代谢底物(脂类)进行适应性防御，但随着代谢底物的大量消耗，最终导致染螨后意蜂成蜂代谢紊乱、寿命缩短，这与Bowen-Walker和Gunn(2001)和Ramsey等(2019)研究结果相似。

本研究仅对染螨条件下意蜂的呼吸代谢进行了初步研究，今后应进一步研究在狄斯瓦螨侵染过程中，与意蜂呼吸相关基因所涉及代谢途径的调控机制，以及蜜蜂机体在适应调节及应激条件下，与呼吸代谢相关因子表达规律及细胞传导途径，对今后开展蜜蜂与寄生螨之间的互作研究奠定基础，为有效防控螨害提供依据。