添加前体氨基酸提高环磷酸腺苷发酵性能

陈宝峰,顾阳,王宝石,常景玲,张中华,李志刚

（1.河南省现代生物育种协同创新中心,河南新乡453003；2.河南科技学院生命科技学院,河南新乡453003）

环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）是一种广泛存在于动物、植物及微生物中的生理活性物质,被称为“第二信使”,广泛参与生物体内糖代谢、脂肪代谢以及核酸和蛋白质合成等重要生命活动[1].该物质能够作为植物生长调节剂和饲料添加剂广泛应用于农作物和畜禽产品的生产中,具有十分重要的应用价值[2-3].

目前,cAMP 的生产方法主要有化学法、酶法、微生物发酵法.微生物发酵法相对于其他两种制备方法具有生产易放大、产物纯度高、环境污染少等优点,能够满足当前经济社会发展的需要,受到越来越多的关注[4].然而,微生物发酵法生产cAMP 过程中存在着一些问题严重制约着其产量的提高.一方面,在cAMP 从头合成过程中嘌呤环的合成需要天冬氨酸（Asp）、谷氨酰胺（Gln）、甘氨酸（Gly）等前体氨基酸的参与[5],由于菌体自身代谢调控机制的作用,使得这些前体氨基酸的含量很低,不能满足cAMP 持续合成的需要[6].另一方面,微生物内氨基酸不仅用于产物的合成,还要用为自身的生长和其它代谢活动正常运转提供充足供应.因此,氨基酸的含量成为限制cAMP 高产的关键因素.有关研究表明,通过外源添加氨基酸能够有效提高某些产物的发酵性能.例如,在腺苷发酵生产中,适量添加谷氨酸能够有效提高腺苷的发酵性能,使得腺苷的产量提高30%以上[7].在S-腺苷-L-蛋氨酸高密度发酵过程中,适量补加前体L-蛋氨酸能显著促进S-腺苷-L-蛋氨酸的积累[8].因此,为进一步提高cAMP 的发酵性能,拟采用适量添加外源氨基酸的方式,在摇瓶培养条件下通过设计正交试验优化出Asp、Gln、Gly 的最适添加条件,并经过发酵罐试验验证,以此来探究添加不同前体氨基酸对环磷酸腺苷发酵性能的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种 筛选节杆菌（Arthrobacter sp.）A.sp01,保藏于中国典型培养物保存中心,保藏号为CCTCC No.M2013431.

1.1.2 培养基成分和其他试剂 斜面培养基（g/L）：葡萄糖10 g,蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,NaCl 3 g,尿素4 g,琼脂20 g,调节pH 值至7.2,121 ℃、高压蒸汽灭菌20 min.

种子培养基：葡萄糖10 g,蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,NaCl 3 g,尿素4 g,酵母膏10 g,调节pH 值至7.2,121 ℃、高压蒸汽灭菌20 min.

发酵培养基：葡萄糖50 g,K2HPO410 g,KH2PO410 g,尿素10 g,生物素0.005 g,CoCl20.01 g,蛋白胨5 g,次黄嘌呤2 g,调节pH 值至7.2,121 ℃、高压蒸汽灭菌20 min.

L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸均购自天津市光复精细化工研究所；试验所用试剂均为分析纯.

1.1.3 仪器LDZX-50KBS 高压灭菌锅,上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD 双人垂直净化工作台,苏净集团安泰公司制造；ZWF-2112 摇床,上海智城分析仪器制造有限公司；UV-2800 紫外分光光度计,上海舜宇恒平科学仪器有限公司；BIOTECH-7BG 机械搅拌式发酵罐,上海保兴生物设备有限公司；Aglient 1260 Infinity 液相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 培养方法 摇瓶培养：250 mL 锥形瓶装30 mL 发酵培养基,121 ℃、高压蒸汽灭菌20 min.接入培养24 h 的种子液,接种量体积分数为10%.摇床培养72 h,培养温度30 ℃、转速220 r/min.

发酵罐培养：7 L 机械搅拌式发酵罐配备pH 计和DO 电极，装有初始葡萄糖质量浓度为80 g/L 发酵培养基5 L,121 ℃、高压蒸汽灭菌20 min,接种量10%,发酵温度30 ℃,pH 控制在6.8,初始搅拌转速为400 r/min、通风量起始为0.1 m3/（m3/min）,随后视溶氧变化情况逐渐调节.

氨基酸添加方法：

a.发酵罐试验.发酵进行至27 h,脉冲式添加Asp 质量浓度0.2 g/L、Gly 质量浓度1.0 g/L、Glu 质量浓度4.0 g/L.

b.单因素摇瓶试验.设置质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L 五个水平的L-天冬氨酸.设置质量浓度为2、3、4、5、6 g/L 五个水平的L-谷氨酸.设置质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L 五个水平的L-甘氨酸.每个水平均设3 个重复.

c.正交试验.考虑到三种氨基酸之间的交互作用,在单因素试验结果的基础上,以cAMP 的产量为评价指标,每种氨基酸设置三个质量浓度水平,设计三因素三水平正交试验,优化获得最优的氨基酸添加方式,并以此作为发酵罐的添加条件.每个组合做三次重复试验,正交试验的因素水平如表1 所示.

表1 因素水平表Tab. 1 Table of the factorial experiment g/L

1.2.2 分析方法 菌体质量浓度测定：采用光密度法测定,发酵液稀释20 倍,用600 nm 波长下的OD 值表示菌体质量浓度[9].

葡萄糖质量浓度测定：采用DNS 法进行测定[10].

cAMP 与次黄嘌呤测定：采用高效液相色谱进行测定[11].

2 结果与分析

2.1 天冬氨酸适宜添加量的确定

cAMP 嘌呤环结构中第1 位氮来自Asp 的α-氨基,因此优化Asp 质量浓度有助于提高菌体从头合成的产苷量.本研究首先在摇瓶上筛选出Asp 的最优添加质量浓度,并以此作为正交试验的试验依据.由于前期分批发酵数据显示次黄嘌呤质量浓度在27 h 基本不变[12],又结合摇瓶的生长特性确定添加时间为30 h.以cAMP 的产量作为选取最适添加质量浓度的标准,如图1 所示：与空白相比,添加Asp 能够提高cAMP 的产量,同时在一定范围内,cAMP 的产量随Asp 的质量浓度的增加而增大,但当达到一定质量浓度之后,cAMP 质量浓度都呈现下降趋势.因此,确定Asp 的适宜添加质量浓度为0.2 g/L.

图1 添加天冬氨酸对cAMP 发酵生产的影响Fig. 1 The effect of aspartic acid addition on cAMP biosynthesis

2.2 谷氨酸适宜添加量的确定

cAMP 嘌呤环结构中第3 位氮及第9 位氮来自于Gln 的酰胺基,因此优化Gln 质量浓度能够促进cAMP 的合成.在实际生产中,由于谷氨酰胺性质不稳定,容易分解失活[13],而生物体内的Gln 是Glu 可以经谷氨酰胺合成酶催化生成,并且谷氨酸性质稳定,来源广泛,便于大规模工业使用.因此,可以选用Glu替代Gln 作为添加氨基酸.如图2 所示：当Glu 质量浓度在2～4 g/L 时,cAMP 质量浓度逐渐升高,当质量浓度为4 g/L 时,cAMP 质量浓度达到最高；随后,当继续提高谷氨酸质量浓度,cAMP 质量浓度不增反降.因此,选取质量浓度为4 g/L 作为谷氨酸的适宜添加量.

图2 添加谷氨酸对cAMP 发酵生产的影响Fig. 2 The effect of glutamic acid addition on cAMP biosynthesis

2.3 甘氨酸适宜添加量的确定

嘌呤环中第4 位、第5 位碳和第7 位氮则来自甘氨酸,因此优化Gly 的含量将有助于cAMP 的合成.如图3 所示,共设置5 个质量浓度分别为0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L 和2.5 g/L 的Gly.随着Gly 质量浓度的增大,cAMP 质量浓度逐渐增大,当Gly 质量浓度为1.5 g/L 时,cAMP 质量浓度达到最大2.37 g/L,随后继续增大Gly 质量浓度,cAMP 发酵质量浓度不增反降.因此,确定质量浓度1.5 g/L 为Gly 适宜的添加条件.

图3 添加甘氨酸对cAMP 发酵生产的影响Fig. 3 The effect of glycin addition on cAMP biosynthesis

2.4 正交试验确定前体氨基酸适宜添加条件

在获得单个氨基酸适宜添加质量浓度的基础上,进一步优化得到最佳的氨基酸添加组合.采用三因素三水平正交试验,通过对三种氨基酸的最优添加质量浓度进行适当地调整,设计了该正交试验.由表2结果分析可知,三种氨基酸中影响菌体产苷的主次关系为：Gly＞Glu＞Asp.三种氨基酸添加的适宜组合为A2B1C2,即Asp 质量浓度为0.2 g/L,Gly 质量浓度为1.0 g/L,Glu 质量浓度为4.0 g/L.进一步对试验结果进行方差分析,分析结果如表3 所示,三种氨基酸对菌体产苷的影响均不显著,分析原因可能是由于正交试验中存在较大误差,且各项自由度较小,从而使检验的灵敏度较低,掩盖了考察因素的差异显著性.综上所述,选取最优的氨基酸组合A2B1C2作为氨基酸添加方式,进行7 L 发酵罐试验.

表2 正交试验设计与结果Tab. 2 Orthogonal array design and results

表3 正交试验方差分析表Tab. 3 Variance analysis for the orthogonal results

2.5 添加氨基酸提高环磷酸腺苷发酵性能

在7 L 发酵罐上进行了添加与不添加氨基酸的发酵试验,探究氨基酸对cAMP 发酵的影响.依照正交试验的优化结果,在发酵27 h,脉冲式添加Asp 质量浓度为0.2 g/L,Gly 质量浓度为1.0 g/L,Glu 质量浓度为4.0 g/L.如图4b 所示,培养基内次黄嘌呤在发酵27 h 基本完全反应,质量浓度维持在0.4 g/L 左右,说明此后cAMP 经从头合成途径生成.添加氨基酸盐发酵批次,在发酵60 h 时cAMP 的产量质量浓度达到3.35 g/L,相比于对照批次发酵72 h 时cAMP 质量浓度为3.32 g/L；产量提高并不显著.然而,发酵时间缩短了12 h,相对于对照批次生产效率提高了21.7%.在一定程度上,添加氨基酸促进了菌体生长并提高了cAMP 的合成能力,如图4（a,c）所示.值得注意的是,添加氨基酸盐促进了葡萄糖的消耗,说明cAMP 从头合成过程能量消耗较大,加剧了微生物对能源物质的需求.

图4 添加前体氨基酸对cAMP 发酵性能的影响Fig. 4 The cAMP fermentation performance with amino acids mixture addition

3 结论

通过单因素与正交试验得到了cAMP 发酵的最优氨基酸添加组合：Asp 质量浓度为0.2 g/L、Gly 质量浓度为1.0 g/L 和Glu 质量浓度为4.0 g/L.利用摇瓶进行发酵试验,cAMP 的产量提高了109.15%.在7L发酵罐上进行验证结果表明,与对照批次相比,脉冲式添加氨基酸混合液发酵时间缩短了12 h,生产效率提高了21.7%.摇瓶与发酵罐实验结果表明添加氨基酸混合液能够提高cAMP 的发酵性能.