吐温80 对麦秆中提取的纤维素同步糖化发酵制乙醇的影响

胡银平,王瑞雪,李冰颍,曹拢财,崔茂金

（河南科技学院化学化工学院,河南新乡453003）

能源是当今人类社会和经济持续发展的物质基础,当今社会利用的主要能源是不可再生的化石能源（煤、石油和天然气）.随着当今社会经济的快速发展,日益增长的能源需求与日益枯竭的不可再生能源的矛盾日益突出,同时化石能源的开发和利用造成的环境破坏与环境污染等问题逐渐突出,预计到2030 年,全世界二氧化碳的排放量将是1990 年的两倍多[1],因此可再生能源的开发和利用成为人们关注的焦点.含量丰富、来源广泛、廉价易得、可再生的生物质资源是化石能源的替代品之一[2-3].农业生物质资源如麦秆、稻秆、玉米秸秆等主要由纤维素、半纤维素和木质素组成,可以通过预处理、糖化和发酵转化为清洁能源乙醇、氢气、生物柴油等[4-5].

将农业生物质通过糖化发酵转化为乙醇是实现农业废弃物再利用的一种重要方法.糖化发酵的反应速度主要取决于酶解反应速度,而纤维素酶的钝化是瓶颈,减少纤维素酶的失活和提高纤维素酶的稳定性是当前研究的热点之一.农业生物质中木质素的存在是影响其糖化发酵效率的关键因素之一.木质素对纤维素酶解副作用主要表现在两个方面：（1）阻碍纤维素吸附纤维素酶；（2）通过疏水相互作用、静电引力和氢键相互作用不可逆地吸附纤维素酶[6-7].为了降低木质素对纤维素酶解的副作用,可以在酶解时添加非离子表面活性剂,由于非离子表面活性剂的疏水部分可以通过疏水的相互作用和底物中残留的木质素结合,从而阻止木质素对纤维素酶的吸附[8-10].糖化发酵时添加非离子表面活性剂能阻止木质素对纤维素酶的无效吸附,从而提高糖化发酵的速度和得率,减少价格昂贵纤维素酶用量.非离子表面活性剂如吐温系列是多种酶的激活剂,对酶活性的保护和增效具有特殊的作用.非离子表面活性剂能是酶在木质纤维素表面的吸附从90%降低到80%,并且能提高纤维素酶的稳定性[11].

研究将非离子表面活剂吐温80 添加到麦秆中提取纤维素,并通过单因素试验和正交试验研究了酵母接种量、酶质量浓度、非离子表面活性剂浓度和发酵时间对同步糖化发酵影响.该研究将为农业生物质的高效利用提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

原料：麦秆于2019 年5 月收集于河南省新乡市郊区,自然晾干、粉碎、过50 目筛后于105 ℃下干燥至恒质量,备用.

试剂：吐温80 购于山东西亚化学工业有限公司；纤维素酶购于西安沃尔森生物技术有限公司；安琪耐高温酿酒高活性干酵母购于安琪酵母股份有限公司.其他试剂均为分析纯.

仪器设备：FY-SXT-02 索氏提取器,杭州川一实验仪器有限公司；JY-6A 恒温搅拌油浴锅,常州金坛良友仪器有限公司；FA1004 型分析天平,天津天有利科技有限公司；101 型电热鼓风干燥箱,巩义市英峪予华仪器T；FZ102 型植物粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司；WFJ7200 型可见分光光度计,上海双旭电子有限公司；SHA-C 型水浴恒温振荡器,巩义市英峪予华仪器厂；DF-101S 型数显集热式磁力搅拌器,巩义市英峪予华仪器厂.

1.2 麦秆中纤维素的提取

麦秆中纤维素的提取方法按照文献[12]方法提取.

1.3 同步糖化发酵

称取1 g 干燥的麦秆于三角瓶中,加入一定量的吐温80,在36 ℃水浴恒温振荡器放置30 min.然后分别加入浓度0.1 mol/L、pH 值为4.8 的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液配制的不同浓度的纤维素酶和5 mL 不同接种量的葡萄糖活化的酵母（固液比为1∶50）,将三角瓶放入36 ℃水浴恒温振荡器中同步糖化发酵不同时间,振荡速度为100 r/min,发酵结束后测乙醇含量.每组试验重复三次取平均值.乙醇含量的测定采用重铬酸钾法[13]进行.

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 酶质量浓度影响 酶质量浓度是影响同步糖化发酵产乙醇的一个重要因素.在发酵温度36 ℃、吐温80 质量浓度1 g/L、发酵时间3 d 和酵母接种量为0.1%下研究了酶质量浓度对麦秆中提取纤维素同步糖化发酵产乙醇的影响,如图1 所示.

从图1 可以看出,随着酶质量浓度的增大,乙醇的含量先增加,当酶质量分数为0.8 g/L 时再继续增加,乙醇含量增加趋于平缓.这是由于酶质量浓度较小时,产乙醇的效率较低；酶质量浓度较大时,由于酶的价格较高,生产成本相应增大,所以选择酶质量浓度为0.8 g/L 进行的单因素试验.

2.1.2 吐温80 质量浓度影响 在发酵温度36 ℃、酶质量浓度0.8 g/L、发酵时间3 d 和酵母接种量为0.1%下研究了吐温80 质量浓度对麦秆中提取纤维素同步糖化发酵产乙醇的影响,如图2 所示.

图2 Tween 80 质量浓度对乙醇含量影响Fig. 2 Effect of Tween 80 mass concentration on ethanol content

从图2 可以看出,随着吐温80 质量浓度的增大,乙醇的含量先增加,当吐温80 质量浓度为0.5 g/L时再继续增大,乙醇含量增加趋于平缓,这是由于非离子表面活性剂浓度较小时,不能有效地阻止木质素对纤维素酶的无效吸附从而使得产乙醇的效率较低.非离子表面活性剂浓度较大时,过量的非离子表面活性剂对阻止木质素吸附纤维素酶没有作用,反而增加了生产成本,所以选择吐温80 质量浓度为0.5 g/L进行单因素试验.

2.1.3 发酵时间影响 在发酵温度36 ℃、酶质量浓度0.8 g/L、吐温80 质量浓度0.5 g/L 和酵母接种量为0.1%下研究了发酵时间对麦秆中提取纤维素同步糖化发酵产乙醇的影响,如图3 所示.

图3 发酵时间对乙醇含量影响Fig. 3 Effect of fermentation time on ethanol content

从图3 可以看出,随着发酵时间的延长,乙醇的含量先增加,当发酵时间为96 h 时再继续延长,乙醇含量增加趋于平缓.这是由于发酵时间较短时,酵母不能完全利用糖化后的糖进行发酵从而使得产乙醇的效率较低；发酵时间较长时, 酵母已经完全利用糖化产生的糖产乙醇从而使得产乙醇的效率不在提高,而发酵时能源消耗会使生产成本较高,所以选择发酵时间为96 h 进行单因素试验.

2.1.4 酵母接种量影响 在发酵温度36 ℃、酶质量浓度0.8 g/L、吐温80 质量浓度0.5 g/L 和发酵时间为96 h 下研究了酵母接种量对麦秆中提取纤维素同步糖化发酵产乙醇的影响,如图4 所示.

图4 酵母接种量对乙醇含量影响Fig. 4 Effect of yeast amount on ethanol content

从图4 可以看出,随着酵母接种量的增加,乙醇的含量先增加后减少,当酵母接种量为0.1%时,乙醇的含量最大.这是由于酵母接种量较少时,酵母不能有效地利用糖化后的糖进行发酵从而使得产乙醇的效率较低；酵母接种量较多时,过量的酵母不但不能提高产乙醇的效率增大生产成本,而且可能会对糖化发酵产乙醇产生抑制作用.

2.2 正交试验

在单因素试验的基础上,为了进一步研究麦秆中提取的纤维素最佳同步糖化发酵工艺条件,选择了酵母接种量（A）、酶质量浓度（B）、吐温80 质量浓度（C）和发酵时间（D）四个因素,每个因素下选择了三个水平,设计了四因素三水平正交试验,正交试验的设计及结果如表1 所示.

表1 正交试验设计及结果Tab. 1 Orthogonal experiment design and results

从表1 可以看出,当同步糖化发酵方案为A1B3C3D3（酵母接种量为0.1%、酶质量浓度为0.8 g/L、吐温80 质量浓度1 g/L 和发酵时间为4 d）时乙醇质量浓度含量最高,为27.35 g/L.从表1 中的极差分析可以看出,四个因素对试验结果影响的主次顺序为：酶质量浓度（B）＞吐温80 质量浓度（C）＞发酵时间（D）＞酵母接种量（A）,吐温80 对麦秆中提取的纤维素最佳同步糖化发酵方案为A1B3C3D2（酵母接种量为0.1%、酶质量浓度为0.8 g/L、吐温80 质量浓度1 g/L 和发酵时间为3 d）,此时乙醇质量浓度为27.99 g/L.表1 中乙醇含量最大值比通过极差得出的最佳条件下的乙醇含量略低,这是由于这两个条件除了发酵时间不同外,其他三个条件完全相同,发酵时间越长,发酵产生的乙醇增加不大,同时乙醇容易挥发,乙醇含量下降.最佳条件下加非离子表面活性剂吐温80 比未加吐温80 乙醇含量提高了5.22%,说明非离子表面活性剂吐温80 对麦秆中提取的纤维素同步糖化发酵产乙醇有促进作用.

对表1 中的试验结果进行方差分析,分析结果见表2.

表2 正交试验方差分析Tab. 2 Variance analysis of orthogonal experiment

从表2 中的方差分析可以看出,四个因素对试验结果影响的显著性顺序为酶质量浓度（B）、吐温80质量浓度（C）、发酵时间（D）、酵母接种量（A）,这与表1 中的极差分析结果得出的主次顺序是一致的.酶质量浓度（B）的F＞F0.05,说明其对试验结果影响极显著；其他三个因素的F＜F0.1,说明其他三个因素对试验结果影响均不显著.

3 结论

通过单因素试验和四因素三水平的正交试验优化了麦秆中提取的纤维素同步糖化发酵的条件.得出如下结论：（1）单因素试验研究结果表明乙醇含量随着酶质量浓度、吐温80 质量和发酵时间的增加先增大后逐渐趋于平缓,而随着酵母接种量的增加先增大后减小.（2）正交试验研究结果表明四个因素对试验结果影响的主次顺序为酶质量浓度、吐温80 质量浓度、发酵时间、酵母接种量.吐温80 对麦秆中提取的纤维素最佳同步糖化发酵条件为酵母接种量0.1%、酶质量浓度0.8 g/L、吐温80 质量浓度1 g/L和发酵时间3 d,此时乙醇含量为27.99 g/L.最佳条件下添加非离子表面活性剂吐温80 使乙醇含量提高了5.22%,说明非离子表面活性剂吐温80 对麦秆中提取的纤维素同步糖化发酵产乙醇有促进作用.