响应面法优化白首乌发酵乳制备工艺

吴隽松，滕飞翔，杨留才

（江苏医药职业学院基础医学部，江苏盐城 224005）

发酵乳是以乳或乳制品为主要原料，通过接种乳酸菌发酵而成[1]，含有丰富的蛋白质、糖类、维生素和矿物质外，还可通过微生物作用将原料中不易吸收的大分子成分转化为易于吸收的小分子物质，同时产生大量的乳酸、其他有机酸、B族维生素、氨基酸、酶类等[2-5]，研究证实，发酵乳有改善肠道菌群、预防肠道疾病、预防心血管疾病、抗衰老以及抗肿瘤等功效[6-8]。随着生活水平的提高，人们对发酵乳的口味、香气、质地、营养和功能的要求越来越多元化[9]，如草莓发酵乳、燕麦芒果发酵乳、藏灵菇发酵乳、黑豆番茄发酵乳、含醇发酵乳等[10-13]，深受人们喜爱。

白首乌（Cynanchum bungei）作为中国传统中药，味甘、苦，性微温，具有补肝肾、益精血、强筋骨、乌须发、延年益寿等作用[14-16]。研究表明，白首乌含有粗多糖、粗蛋白、粗脂肪、维生素、氨基酸以及钙、铁、锌、镁等人体必需的矿物质元素，其含有的多羟基孕甾烷苷酯类化合物和苯乙酮类化合物，已被证实具有抗肿瘤、抗衰老、抗炎、抗氧化和降血脂等功效[17-20]。目前，由白首乌加工得到的食品多为初加工，如制成白首乌粉、白首乌片、白首乌脯等形式，但存在即食性差、营养损失严重，造成资源的浪费和环境污染等问题[21]。利用微生物发酵作用制备白首乌酵素成为研究热点，李凡等[22]以纯白首乌清汁为发酵基质，乳酸菌和酵母菌复合发酵制成一种含有大量活菌的白首乌酵素。但是市面上关于白首乌发酵乳制备及其抗氧化性研究较少。因此，本研究以江苏盐城市滨海白首乌粉和奶粉为原料，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌为发酵剂，利用双响应值优化白首乌发酵乳饮料制备工艺，得到一款风味独特、抗氧化性能较高的白首乌发酵乳，从而为白首乌资源开发和白首乌产业发展提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料与菌株

白首乌、牛乳、蔗糖（食品级）：市售；德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbruechiisubsp.bulgaricus），CGMCC 1.2161、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），CGMCC 1.1855：中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 试剂

MRS培养基：杭州百思生物技术有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒[2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）法]：北京盒子生工科技有限公司。

1.2 仪器与设备

S1-M81磨粉机：九阳股份有限公司；YP2001B电子天平：上海力辰仪器科技有限公司；PYX02电热恒温培养箱：FD-2D-80真空冷冻干燥机：上海继谱电子科技有限公司；佰辉电子有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：上海笃特科学仪器有限公司；UV752紫外分光光度计：山东博科科学仪器有限公司；PHS-25酸度计：上海越平科学仪器有限公司；DYCZ-24N垂直电泳仪：北京六一生物科技有限公司；Trans-Blot SD转膜系统：上海赛百奥科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白首乌发酵乳制备工艺及操作要点

白首乌预处理→破碎过筛→加入奶粉及蔗糖→均质→灭菌→接种→发酵→后熟→无菌灌装→成品

操作要点：白首乌清洗后，切成厚0.5 cm左右的片状，真空冷冻干燥12 h后破碎磨粉，过60～80目筛后按一定比例加入奶粉和蔗糖后于5 MPa、50～60 ℃条件下均质，然后120～130 ℃条件下瞬时灭菌后，降至25～28 ℃，按1∶1比例接种德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌，在1%～5%接种量、28～32 ℃温度一定条件下发酵6～30 h，然后在4 ℃冰箱中后熟12～24 h，最后无菌灌装，得到一款营养丰富、风味独特的白首乌发酵乳。

1.3.2 白首乌发酵乳制备条件优化单因素试验

为使产品风味独特、口感更为柔和，对其过筛目数、白首乌粉、奶粉和蔗糖的添加比例、菌种接种量、发酵温度、发酵时间进行优化，以感官品评作为评价指标。选定白首乌粉过筛目数为50、60、70、80、90目，白首乌、奶粉和蔗糖的添加质量比为1∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2、2∶1∶1、1∶2∶2，菌种接种量为1%、2%、3%、4%、5%，发酵温度分别为28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃，发酵时间分别为6 h、12 h、18 h、24 h、30 h，研究这几个因素对白首乌发酵乳感官评分影响。

1.3.3 白首乌发酵乳制备条件优化响应面试验

选取单因素试验中对响应值（感官评分）有显著影响的因素，菌种接种量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C），设计3因素3水平响应面试验，响应面试验因素与水平见表1。

表1 白首乌发酵乳制备条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for preparation process optimization of Cynanchum bungei fermented milk

1.3.4 测定方法

感官评定：由50名评审员（具有食品感官品评经验的学生）从色泽、滋味与香味、口感、组织状态等方面进行评分，感官评定标准如表2所示。

表2 白首乌发酵乳感官评定标准Table 2 Sensory evaluation standards of Cynanchum bungei fermented milk

ABTS法抗氧化活性测定：依据参考文献[23]的操作方法，绘制的得到标准曲线回归方程为y=5.152 4x-3.680 1，相关系数R2为0.996。然后以同样的方法测定白首乌发酵乳维生素C含量，ABTS值以维生素C当量（vitamin C equivalent，VCE）表示。

活菌数的测定：依据参考文献[24]的操作方法，计算白首乌发酵乳中的活菌数。

酸度测定：依据参考文献[25]的操作方法，记录白首乌发酵乳消耗标准氢氧化钠溶液体积，计算白首乌发酵乳酸度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 过筛目数对白首乌发酵乳感官及抗氧化能力的影响

由图1可知，在50～90目范围内，随着过筛目数的增大，感官评分呈先增高后降低趋势，在80目时达到最高，此时感官评分达到88分，增高的原因可能是由于目数增加，白首乌粉粒度越来越小，口感及组织状态更为细腻、柔和，从而感官评分上升，当粉碎过细时，易于粘结成块，不利于微生物作用，从而使得发酵不完全导致感官评分下降；与此同时，在50～80目范围内，ABTS值随目数增加呈先增高后降低趋势，在80目时达到最高值，为575.45 mgVCE/L，表明随着白首乌粒度越小，原料利用率越高，活性成分形成越多，但当粒度过细时易于粘结成块，不利于微生物作用，从而使得发酵不完全导致抗氧化性能下降。因此，选择过筛筛目为80用于后续试验。

图1 过筛目数对白首乌发酵乳感官评分和抗氧化能力影响Fig.1 Effect of meshes on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

2.1.2 白首乌粉、奶粉和蔗糖添加质量比对白首乌发酵乳感官及抗氧化能力的影响

图2 添加原料质量比对白首乌发酵乳感官评分和抗氧化能力影响Fig.2 Effect of addition mass ratio of material on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

由图2可知，随白首乌粉、奶粉和蔗糖添加比例的变化，白首乌发酵乳的感官评分呈先降低后升高再降低的趋势，当白首乌粉∶奶粉∶蔗糖=1∶2∶2时感官评分达到最高，为90分，此时白首乌发酵乳奶香突出，有淡淡药香，且酸甜可口，原因是此时奶粉、蔗糖、白首乌粉发酵生成的糖酸比合适，且白首乌香气不突出；当白首乌粉∶奶粉∶蔗糖=2∶1∶1时，白首乌发酵乳ABTS值最高，为581.32 mgVCE/L，其次为1∶2∶2，ABTS值为573.2 mgVCE/L，但此时白首乌粉比例为最低，原因可能是由于奶粉、蔗糖比例较高，微生物发酵作用较好，导致的白首乌中抗氧化成分溶于发酵乳以及微生物作用生成较多抗氧化物质所致。因此，综合考虑感官评分和ABTS值，选择白首乌粉∶奶粉∶蔗糖=1∶2∶2添加比例用于后续试验。

2.1.3 接种量对白首乌发酵乳感官及抗氧化能力的影响

图3 接种量对白首乌发酵乳感官评分和抗氧化能力影响Fig.3 Effect of inoculum on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

由图3可知，在接种量1%～4%范围内，随着接种量的增加，感官评分逐渐增加，当接种量为4%时达到最高，最高为86分，此时白首乌发酵乳酸度较为适中，酸甜比较为合适，当接种量＞4%时，酸度过高，导致感官评分下降；接种量对白首乌发酵乳抗氧化活性也有一定影响，ABTS值在接种量为1%～3%范围内逐渐增高，3%达到最高，为554.4 mgVCE/L，随后趋于平缓，表明接种量增加在1%～3%范围内可以加快发酵过程中抗氧化活性物质的形成。由于接种量的增加，微生物对原料的利用率增加，白首乌粉中抗氧化物质（如多酚黄酮等）成分会随着微生物的作用从其细胞壁中释放到发酵体系中，从而引起抗氧化活性增高。但是，如果接种量过多，微生物生长也会消耗更多的营养物质，同时也会导致部分抗氧化物质转化或分解，使得抗氧化活性降低。因此，选择最适接种量为4%用于后续试验。

2.1.4 发酵温度对白首乌发酵乳感官及抗氧化能力的影响

图4 发酵温度对白首乌发酵乳感官评分和抗氧化能力影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

由图4可知，在28～32 ℃范围内，感官评分随着发酵温度的升高呈先增加后降低趋势，发酵温度为31 ℃时，感官评分达到最高为83分，温度过低或过高，会造成微生物较少或者较多，菌种活性较差，同时发酵产生的乳酸过低或过高，从而使得感官评分较低；ABTS值随发酵温度变化趋势与感官评分变化趋势与一致，发酵温度为31 ℃时，ABTS值达到最高为562.3 mgVCE/L，可能是由于适宜的温度使得白首乌发酵乳菌的数量和活性较为适中，从而通过微生物作用，使得白首乌发酵乳抗氧化活性较高。因此，选择发酵温度为31 ℃用于后续试验。

2.1.5 发酵时间对白首乌发酵乳感官及抗氧化能力的影响

图5 发酵时间对白首乌发酵乳感官评分和抗氧化能力影响Fig.5 Effect of fermentation time on sensory score and antioxidant capacity of Cynanchum bungei fermented milk

由图5可知，在6～24 h范围内，随着发酵时间的延长，感官评分呈先增加后降低趋势，当发酵时间为24 h时，感官评分达到最高，为86分，随后降低，表明随着发酵时间的延长，菌的数量逐渐增加，乳酸等有机酸逐渐增加，在24 h达到较优的甜酸比，随后，酸度继续增加，引起过酸的不适感，导致感官评分降低；在6～18 h范围内随着发酵时间，ABTS值逐渐增加，发酵时间为18 h时，达到最高为583.6 mgVCE/L，随后呈降低趋势，可能是由于发酵时间过长会引起白首乌发酵乳中活性成分的分解。同时发酵时间的延长会引起生产周期长、成本高等，因此，选定发酵时间为18 h。

2.2 双响应值联合优化白首乌发酵乳工艺

采用Design Expert 10软件设计Box-Behnken试验，在过筛数目为80目，白首乌粉∶奶粉∶蔗糖=1∶2∶2条件下，以白首乌发酵乳感官评分（R）为响应值，优化接种量（A）、发酵温度（B）及发酵时间（C），获得白首乌发酵乳最佳发酵条件。Box-Behnken 试验设计及结果见表3。

响应值（感官评分）所得的回归方程为：

回归方程方差分析见表4。由表4可知，所设定的各发酵因素对感官评分影响顺序为A＞B＞C，即接种量＞发酵温度＞发酵时间，三者对于感官评分影响显著（P＜0.05），交互项BC以及二次项A2、B2、C2对感官评分的影响显著（P＜0.05），交互项AC对感官评分影响极显著（P＜0.01）；感官评分回归模型达到极显著水平（P＜0.01），失拟项P值不显著，表明回归方程拟合度较好，在自变量范围内能较好的反映响应值变化，可用于白首乌发酵乳优化工艺参数的理论值预测。

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

发酵条件交互作用对感官评分影响的立体分析图分别如图6。由图6可知，接种量、发酵时间和发酵温度这三个因素交互作用在感官评分响应面立体图上均存在极值，发酵温度与发酵时间的侧剖面图弧度大于接种量的侧剖面弧度，表明发酵温度和发酵时间对感官评分模型的影响大于接种量的影响，从响应面立体图的投影，发酵温度和发酵时间的等高线图更接近椭圆，表明二者交互作用较显著。

预测白首乌发酵乳最佳发酵工艺参数为：接种量4.86%、发酵温度为30.25 ℃、发酵时间为10.8 h。在此条件下，感官评分理论值为90分、ABTS理论值为585.7 mgVCE/L。为操作方便，对预测最优值进行调整，选定接种量5%、发酵温度为30 ℃、发酵时间为11 h作为最佳发酵工艺参数。然后进行验证试验，结果显示，在此条件下感官评分实际值为88分、ABTS实际值580.2mgVCE/L，实测值与预测值无显著性差异。

图6 接种量、发酵温度、发酵时间交互作用对白首乌发酵乳感官评分影响的响应曲面及等高线Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between inoculum,fermentation temperature and time on sensory score of Cynanchum bungei fermented milk

2.3 白首乌发酵乳活菌数与酸度测定

测定优化后工艺制备的白首乌发酵乳中的活菌数和酸度，结果显示，白首乌发酵乳中乳酸菌活菌数为2.2×108个/mL≥1×106个/mL，大肠杆菌数≤1 CFU/mL；致病菌未检出，其酸度测定值为85°T≥70°T，均符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》。

3 结论

以白首乌粉、奶粉和蔗糖为原料，德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌为发酵剂，在单因素试验的基础上，采用响应面法优化白首乌发酵乳工艺参数，最终得到：在过筛目数70目、白首乌粉∶奶粉∶蔗糖添加质量比为1∶2∶2、接种量为4%、发酵温度为30 ℃、发酵时间为11 h条件下，感官评分和ABTS值最高，分别为88分和580.2 mgVCE/L，此时活菌数2.2×108个/mL，酸度为85°T，即得到一款口感柔和、风味独特、滋味鲜美、抗氧化活性高的白首乌发酵乳。