C/EBP同源蛋白(CHOP)在内质网应激诱导的细胞凋亡中的作用

王占宇，惠慧，郭青龙

(江苏省南京市鼓楼区童家巷24号中国药科大学玄武门校区，江苏省肿瘤发生与干预重点实验室，江苏 南京 210009)

0 引言

内质网(ER)是广泛存在于真核生物中，在蛋白质的合成、修饰和加工起着关键作用，负责蛋白质的折叠、装配和肽链的运输。通常，ER具有强大的动态平衡系统，但是在一些生理和病理状态(如局部缺血、病毒感染、pH变化等)下，可能会引起内质网应激。内质网应激与多种疾病有关，例如神经退行性疾病、代谢性疾病、局部缺血性疾病和肿瘤等。其中CHOP(C/EBP同源蛋白)是内质网应激介导的细胞凋亡途径的组成部分之一，在内质网应激中发挥着至关重要的作用。

1 CHOP的结构和特征

CHOP蛋白属于CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPs)家族，首次发现于UV辐射和烷基化剂甲磺酸甲酯的研究中[1]。CHOP也被称为生长阻滞基因、DNA损伤诱导基因153(GADD153)、DNA损伤诱导转录本3(DDIT3)和C /EBPζ，是一种29KD的哺乳动物核蛋白。其N端具有转录激活功能，C端则为碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构域[2]。研究表明，CHOP能够参与调控细胞的增殖、分化及能量代谢。通常，CHOP的表达非常低，但是它可以通过在多种细胞类型中诱导应激的扰动而强烈表达并在细胞核中蓄积[3]。CHOP在内质网应激诱导的细胞凋亡中起着重要作用，因此CHOP也成为越来越多研究人员关注的焦点。

2 CHOP在内质网应激诱导细胞凋亡中的作用

2.1 CHOP的上游调控通路

细胞通过一系列的精准调控来保证蛋白质的正确折叠，然后从内质网中转运出来执行其各自的功能。当内质网稳态被打破后，内质网中错误折叠或未折叠的蛋白质增加并通过内质网膜向细胞核传递应急信号，即未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)[4]。在病理状态或者微生物感染时，发生不可逆的内质网应激，CHOP的表达急剧上调，从而激活细胞凋亡。CHOP表达的主要受三个因素调控：蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、肌醇需求酶1(IRE1)和转录因子6(ATF6)。

2.1.1 PERK

PERK是在细胞中普遍表达的Ⅰ型跨膜丝氨酸苏氨酸激酶，具有连接到GRP78的ER腔结构域和胞质结构域。PERK蛋白能够形成四聚体，从而进一步增加其激酶活性[5-6]。在UPR发生时，PERK从GRP78上解离下来，经过寡聚化和磷酸化后激活。激活后PERK的主要靶点为真核起始因子2α(eIF2α)，能够使eIF2α上的51位丝氨酸磷酸化[7]。磷酸化的eIF2α会抑制eIF2β，从而降低蛋白质翻译和折叠速率，使蛋白质总体合成量暂时减少，从而让细胞重新折叠蛋白质或者降解ER中的未折叠蛋白质。同时，磷酸化的eIF2α选择性上调ATF4[8]。通常，ATF4的转录水平较低，上调后可以参与蛋白质平衡的调节、抗氧化应激和自噬反应相关基因的表达等[9]。重要的是，ATF4和p-eIF2α能够增加CHOP的转录与翻译。在持续的ER应激期间，ATF4和CHOP会导致细胞周期阻滞和凋亡相关分子相关的基因表达。研究表明，PERK -/-和ATF4 -//细胞和eIF2α(Ser51)敲入细胞在ER应激期间无法诱导CHOP。无论是在体外还是体内，PERK / ATF4 / CHOP信号通路均被认为在诱导细胞凋亡中起关键作用[10]。

2.1.2 IRE1

IRE1α由内质网至细胞核信号传导1(ERN1)基因编码，在人体细胞中普遍表达。IRE1α可以三种生理形式存在，即在氨基末端腔结构域(NLD)上与GRP78结合的非活性单体形式，以及活性二聚体或多聚体形式[11]。与PERK一样，IRE1α在结构上相对保守且具有相似的同源结构域，用来进行二聚化和接受UPR信号。GRP78解离后，触发IRE1α寡聚化，其胞质激酶结构域的激活以及Ser724，Ser726和Ser729残基的磷酸化[12]。磷酸化后的IRE1α能够发挥核酸内切酶的作用，将X盒结合蛋白1(XBP1)的mRNA剪接成XBP1的剪接同工型(sXBP1)和含有26个核苷酸的内含子[13]。sXBP1能够响应ER应激信号，促进伴侣蛋白、折叠酶和ER相关降解(ERAD)组分的转录，并调节CHOP的基因表达。IER1α与TNF受体相关因子2(TRAF2)相互作用下，还可以刺激凋亡信号激酶1(ASK1)的的激活，然后通过下游激酶Jun-N末端激酶(JNK)和p38促丝裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)，从而导致细胞凋亡。在诱导凋亡的研究中，JNK的抑制剂SP600125能够抑制CHOP的上调，这表明JNK的激活也参与了CHOP的调节[14]。

2.1.3 ATF6

ATF6是一个90KD的II型ER转膜蛋白，有α和β两种亚型。两种亚型在各类组织细胞中均有表达，但是在UPR信号传导中，ATF6α占主导地位[15]。与IRE1和PERK相似，在没有ER应激时，GRP78与ATF6结合，ATF6处于非活性形式。当接收到ER应激信号后，GRP78与ATF6之间的二硫键断开，ATF6以COPII依赖性方式转移到高尔基体，并被高尔基体上的Site-1蛋白酶(S1P)和Site-2蛋白酶(S2P)切割，产生活性转录因子N-ATF6。随后，活化后的ATF6进入细胞核，诱导ERAD上调CHOP的表达[16]。此外，ATF6还可以激活XBP-1的转录，而XBP-1也可以调节CHOP的表达。因此，ATF6可以与XBP-1协同激活CHOP。

在内质网应激三条通路均能够上调CHOP，但是PERK途径中ATF4的选择性上调占据着主导地位。ATF4的翻译能够诱导CHOP和其他参与氨基酸代谢、转运以及氧化还原相关的基因转录[17]。下游CHOP中的AARE是CHOP启动子氨基酸激活的必需基序。虽然ATF2和ATF3可以识别CHOP AARE，但是在ER应激过程中两者对CHOP的诱导作用尚不明确。

2.2 CHOP的下游调控通路

2.2.1 CHOP通过线粒体依赖性途径诱导细胞凋亡

多种促凋亡信号作用在线粒体膜上，BCL-2家族蛋白在线粒体膜上形成蛋白质通道，线粒体还能够释放凋亡活性物质(如细胞色素C，Smac等)。这些激活了下游的半胱天冬酶家族蛋白并作用于相应的底物，从而引发细胞凋亡[18]。

CHOP作为转录因子，能够调节多种抗凋亡和促凋亡基因的表达，如BCL-2家族蛋白、GADD34、TRB-3和DOCs等。内质网应激作用下，CHOP可以作为转录激活因子或阻遏蛋白，通过bZIP结构域与其他C/EBP家族转录因子相互作用形成异源二聚体[19]。CHOP能够下调BCL-2、BCL-XL和MCL-1的表达，上调BIM的表达，并进一步增加BAK、BAX的表达[20]。BAK-BAX寡聚化后，寡聚体经线粒体促进凋亡因子细胞色素C(Cyt-C)和凋亡诱导因子(AIF)的释放，最终导致细胞死亡[21]。

TRIB3是Tribbles同源蛋白家族成员之一，位于CHOP的下游且受其调控。研究表明，在非心脏细胞缺氧和内质网应激发生时，TRIB3的表达会增加[22]。TRIB3的表达能抑制Akt活性，并且具有促凋亡能力[23]。Akt直接调节caspase-3和caspase-9以及线粒体促凋亡蛋白BAX和BAD的表达。TRIB3也可以通过抑制Akt Ser473和的Thr308位点磷酸化从而抑制Akt的抗凋亡活性[24]。TRIB3表达的上调激活caspase-3，从而增强细胞凋亡。因此CHOP还通过上调TRIB3基因的表达来调节细胞凋亡，直接或间接影响caspase的活性。

2.2.2 CHOP通过死亡受体途径诱导细胞凋亡

内质网应激也能够通过外援途径介导细胞死亡。死亡受体(DR)DR4或DR5与死亡配体(Fas、TNF、TRAIL)结合从而引起细胞凋亡[25]。DR5基因位于8p染色体上，具有两个剪接变体。PERK-ATF4-CHOP途径可通过与死亡受体途径结合并上调死DR4和DR5的表达，而CHOP作为转录因子对DR5的表达起着关键性的调控作用[26]。在DR5启动子-276和-264之间具有CHOP的结合位点(+1表示翻译的起始位点)[27]。此外，ER应激可激活TRAIL-R1/DR4死亡受体。CHOP与磷酸化转录因子JUN相互作用形成复合物，该复合物与DR4的启动子区域结合。CHOP的N末端结构域与磷酸化的JUN相互作用，形成调节DR4和DR5表达的复合物。

研究表明，CHOP-DR5通路会让癌细胞对活性氧(ROS)介导的外源性凋亡信号敏感[28]。当内质网应激不可逆时，PERK-CHOP功能将持续存在，从而使DR5 mRNA升高。ER和高尔基体中DR5的积累可以驱动死亡受体5(DR5L)的长剪接变体多聚化，DR5L促进死亡诱导信号复合物(DISC)的形成并激活caspase-8[29]。caspase-8的激活还可以促使位于细胞质中的BID裂解为tBID[30]。tBID具有强大的促凋亡活性，并且可以通过BAK和BAX作用于线粒体膜，从而导致Cyt-C释放。随后，通过外源和内源性途径导致凋亡[31]。

2.2.3 CHOP通过其他途径诱导细胞凋亡

除了通过内源性和外源性途径介导凋亡外，CHOP还可以通过其他途径介导凋亡。CHOP能够增加ER还原酶基因的表达，ER还原酶基因可以催化蛋白二硫键异构酶(PDI)氧化，从而导致ER中H2O2产生并进入细胞质，诱导ROS的生成进而导致细胞凋亡和炎症反应。ER中ROS浓度过高时，会激活IP3R1钙离子释放通道，从而使钙离子进入细胞质[32]。细胞质中的钙离子通过激活钙敏感激酶CaMKII(钙依赖性蛋白激酶)和细胞膜上NADPH氧化酶的亚基NOX2进一步促进ROS释放，继而激活CHOP的转录，导致细胞凋亡[33]。此外，ROS清除剂可以减弱PERK/eIF2α/CHOP途径相关蛋白的表达[34]。

GADD34也是CHOP下游的一种促凋亡靶点。GADD34可以促进磷酸化eIF2的去磷酸化，从而恢复蛋白质翻译。在CHOP-/-细胞中，GADD34表达受损可降低蛋白负荷和内质网应激[35]。

CHOP过度表达会导致细胞周期停滞并导致细胞凋亡。同时，CHOP还可以通过抑制细胞周期调节蛋白p21的表达来引起细胞死亡。p21蛋白不仅抑制细胞周期的G1期，而且与凋亡前因子的活性密切相关[36]。

有研究发现，CHOP通过与FOXO3A和AP-1复合蛋白cJUN相互作用来调节仅含有BH3结构的蛋白表达，从而导致其磷酸化。CHOP的敲低阻止了其下游目标FOXO3a(Thr32)的去磷酸化[37]。

从理论上讲，CHOP依赖性细胞凋亡主要是通过直接或间接改变促凋亡或抗凋亡基因的表达来介导的。总的来说，凋亡途径是由CHOP的下游靶标介导的。然而，发生这种情况的分子相互作用机理仍有待了解。

3 结论与展望

维持内质网的动态平衡是细胞的重要特性，但是内质网应激也会导致细胞凋亡。当内质网发生过度应激时，细胞启动凋亡程序，从而触发细胞死亡。越来越多的研究表明，内质网应激与许多人类疾病的发病机制有关。神经退行性疾病的发病机理可能与蛋白质错误折叠息息相关，关键功能蛋白的许多突变与CHOP的上调有关，例如内质网应激可能在包括阿尔茨海默病在内的许多疾病的病理生理中起作用[38]。此外，大量证据表明，CHOP依赖的细胞死亡途径可能与小鼠从心脏肥大到心力衰竭的转变有关[39]。心肌梗死后大鼠心力衰竭中心肌细胞中CHOP，caspase-12和GRP78的表达下调。在肿瘤微环境中，缺氧、酸性pH、血管形成不良等都是ER应激的激活因子，已经证明CHOP可在ER应激中触发肿瘤细胞死亡。CHOP诱导的凋亡在病毒或细菌感染期间也起着关键作用[40]。但关于CHOP在各种生理和病理条件下的作用，仍有许多问题需要解答。因此，有必要清楚地阐明CHOP诱导的凋亡途径。