黑暗处理对百里香挥发性物质日变化的影响

司家屹，王祎琛，毛俊俨，杨秀云

(山西农业大学林学院，功能油料树种培育与利用山西省重点实验室，山西 太谷 030801)

植物挥发性物质是植物次生代谢产生的具有挥发性的小分子有机化合物[1]，具有重要的观赏、经济和医药价值[2-4]，对于植物自身抵御逆境、促进繁殖、适应环境也具有重要意义[5-7]。由于植物自身状态以及外界环境条件的改变，植物挥发物的合成与释放是动态变化的，并呈现一定的节律[8]。研究表明植物挥发物的合成与释放存在以24小时为周期的日变化，即昼夜节律。例如山桃草(GauralindheimeriEngelm. et Gray)在白天挥发物释放量大[9]，而东方百合‘西伯利亚’(Lilium‘Siberia’)释放的萜烯类化合物在一天当中呈先升高后降低的趋势[10]。光照是使植物体内生物钟与昼夜变化同步的一种授时因子，也是影响植物代谢的重要因素[11]。正常光照下植物会通过生物钟核心调控元件对环境中光照信号进行整合，协调代谢活动[12]。给予植物黑暗处理时，光照因子剧烈变化，植物代谢也变化剧烈。研究黑暗处理下与正常光照下挥发性物质的日变化规律，对于揭示黑暗对挥发性物质释放的影响具有重要意义。

百里香(Thymusmongolicus)是唇形科百里香属植物，不仅具有观赏价值，还具有很高的经济与生态价值，可用于食用、药用、畜牧、蜜源、园林观赏、防风固沙等方面[13-14]。并且百里香全株具有香气，也是一种具有开发价值的芳香植物。本试验将长势一致、无病虫害的当年生百里香分别置于黑暗处理和正常光照中，使用气质联用法(HS-SPME/GC-MS)对其释放的挥发性物质进行采集，探究黑暗处理对百里香挥发物释放日变化节律的影响，为探明植物挥发物释放机理提供一定理论基础，同时为百里香的有效开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

百里香种源来源于山西省浑源县自然生长的群落(经度113 °72 ′66.97 ″，纬度39 °63 ′77.52 ″，海拔1 363.45 m，无霜期140 d，年均气温6.2℃，年降水量388.0 mm，年日照时数2 627.0 h)，2015年引种到山西农业大学苗圃种植。2019年5月12日选择长势一致的当年生百里香枝条进行扦插繁殖，将其均栽植于7 cm×7 cm的花盆中，栽培基质为混合土壤(混合土壤的体积比为原土∶砂土∶腐殖质=2∶1∶1)。管理过程中的水、肥及光照条件保持一致，2019年9月12日选取枝叶繁茂、无病虫害、长势一致的百里香扦插苗进行试验处理。

1.2 试验方法

试验设置2个处理，每个处理重复3次。对照组为置于正常光照环境下的百里香，试验组于试验当天早晨6:00采用PVC黑色遮荫网进行处理，遮荫棚南北向放置，便于通风透气，东西向遮荫网设于距地面150 cm处。(试验各时段采用TES-1334A照度计测定光照，均为0 lux)花盆之间保持30 cm以上的距离，避免植株冠层间受光干扰影响。采用多株混合取样法，每隔4小时(取样时间为0:00；4:00；8:00；12:00；16:00；20:00)采集长势一致、位置相同的百里香健康叶片。将采集叶片用蒸馏水冲洗干净，并用滤纸擦干，混匀后精确称取0.50 g放置于5 mL萃取瓶中密封。

挥发物质测定方法采用气相色谱质谱联用(HS-SPME/GC-MS)技术[15]。GC(Gas Chromatography，trace 1300型号，Thermo Fisher公司生产)条件设计为色谱柱为HP-5MS石英毛细管柱，起始温度为40℃，停留3 min，以5℃·min-1升温270℃，停留6 min。进样口温度为270℃，载气为高纯氦气，流速为1.0 mL·min-1，不分流进样。萃取头为DVB/CAR/PDMS，50℃震荡15 min，吸附5 min，进样口270℃解吸附5 min。MS(Mass Spectrometry，trace ISQ型号，Thermo Fisher公司生产)质谱的离子源为EI源，离子传输线250℃，离子源温度为230℃，质量扫描范围50～550 amu。

1.3 数据分析

使用计算机质谱数据库NBS对采集到的质谱图进行检索，采取峰面积归一化法计算检测出的化学物质的相对含量(将样品中所有能检测出峰的化合物的峰面积之和视作1，每个组分的峰面积与总峰面积的百分比代表其相对含量)[16]。使用Excel 2013进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 黑暗处理对挥发物种类日变化的影响

正常光照下的百里香在6个采样时间内共检测出80种挥发性物质，而黑暗处理下检测出挥发物质77种。主要包括烯烃类、芳香烃类、醇类、酚类和酯类5大类。其中烯烃类挥发物种类数明显高于其余类别的化合物。黑暗处理对百里香释放的挥发物质种类波动趋势有明显的影响，正常光照下挥发物种类出现两个低谷(12∶00和0∶00)，种类数分别为36种和33种，挥发物种类峰值出现在8∶00，检测出50种挥发物，其余3个时段均检测出41种挥发物。黑暗处理下挥发物种类的波动趋于平缓，夜间释放种类数量基本相等(20∶00，0∶00，4∶00分别为38种、36种和37种)，早8∶00释放种类30种，12∶00和16∶00分别释放种类26种和25种。

不同类型挥发物对黑暗处理的响应不同。正常光照和黑暗处理下烯烃类挥发物的日变化均呈波动趋势，但正常光照下的波动较大，范围为15～27种，黑暗处理下的波动较小，范围为12～17种。芳香烃类正常光照下数量在5～7种范围内波动，黑暗处理下8∶00释放最多为9种，其余时间为4～5种。黑暗处理对醇类化合物数量日变化趋势也有影响，正常光照下最大值出现在8∶00(9种)，最小值出现在12∶00(5种)，黑暗处理下的醇类挥发物数量在白天少(8∶00-16∶00为1～3种)，在夜晚多(20∶00-4∶00为6～8种)。正常光照下酚类挥发物数量最大值出现在16∶00(为3种)，0∶00挥发物数量最少(1种)，黑暗处理下12∶00、16∶00未释放酚类挥发物，其余时间均释放了1种。酯类挥发物数量在正常光照下8∶00-12∶00上升(2～4种)，之后变化较为和缓(1～2种)，在黑暗处理组中8∶00-16∶00上升(0～4种)，16∶00-0∶00下降(4～2种)。

图1 正常光照及黑暗处理两种处理对挥发物种类日变化的影响Fig.1 Effects of normal and dark treatments on diurnal variation of volatile species

2.2 黑暗处理对不同挥发物相对含量日变化的影响

2.2.1黑暗处理对烯烃类挥发物相对含量日变化的影响 研究表明(表1)，烯烃类物质是百里香挥发性物质的主要种类，黑暗处理对于烯烃类挥发物的日变化趋势及幅度均有影响。黑暗处理组的烯烃类挥发物相对含量变化范围为38.24%～51.47%，正常光照组的为44.08%～49.58%，黑暗处理组的变化范围是正常光照组的41.57%。正常光照下烯烃类挥发物相对含量在20∶00时出现低谷(38.24%)，其余时段相对含量变化平缓(48.50%～51.50%)。黑暗处理下4∶00和8∶00烯烃类化合物相对含量出现高峰(分别为48.01%和49.58%)，其余时段释放较少(44.08%～46.72%)。

有7种烯烃类物质是所有样本共有的，黑暗处理对不同物质相对含量日变化有不同影响。正常光照下的r-萜品烯相对含量呈升高-降低-升高-降低的趋势，黑暗处理下的仅在12∶00-20∶00时变化趋势与正常的相反，其余时间相同。正常光照下和黑暗处理下水芹烯相对含量日变化均较小。4-甲基-1-异丙基二环[3.1.0]己-2-烯相对含量在正常光照下呈下降-上升-下降趋势，8∶00出现高峰(4.38%)，黑暗处理下出现高峰的时间提前到4∶00(4.03%)，其余时间较为和缓(3.01%～3.41%)。光照下8∶00,12∶00桧烯的相对含量较高(0.97%～1.67%)，黑暗处理下4∶00的相对含量最高(1.07%)，其余时间正常光照和黑暗处理下的桧烯相对含量变化均较小(0.62%～0.74%)。正常光照下莰烯相对含量在8∶00-20∶00从3.11%下降至0.09%，到0∶00和4∶00有所升高(2.57%和2.25%)，黑暗处理的则在1.01%～2.05%范围内不断波动。大牛儿烯D在正常光照下的变化趋势与r-萜品烯的一致，但在黑暗处理下呈先下降再上升趋势，且变化幅度更小。正常光照下Δ-杜松烯在12∶00与20∶00释放较少，仅为0.40%，16∶00释放较多，为2.25%，黑暗处理的仅8∶00释放较多(1.06%)。

表1 百里香叶片中烯烃类挥发物相对含量日变化Table 1 Diurnal variation of relative content of olefin volatiles in Thymus mongolicus leaves

续表1

Note∶"-" means the presence of this volatile substance is not detected in this sample,the same as below

2.2.2黑暗处理对芳香烃类挥发物相对含量日变化的影响 黑暗处理下的芳香烃类挥发物相对含量均大于正常光照下的，并且黑暗处理对其日变化有影响。黑暗处理组的芳香烃类挥发物相对含量变化范围为20.17%～26.38%，正常光照组的为28.50%～32.29%，黑暗处理组的变化范围是正常光照组的61.03%。0∶00时正常光照下的芳香烃类挥发物相对含量较高(26.38%)，其余时间较为和缓(20.17%～23.65%)。黑暗处理中的则在8∶00-20∶00释放较多(30.72%～32.29%)，0∶00，4∶00释放较少(28.50%，29.06%)。

检测出的11种芳香烃类挥发物中，邻-异丙基苯和2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯是所有检测样本中共有的。正常光照与黑暗处理下，邻-异丙基苯最小值均出现在8∶00(正常光照下为15.61%，黑暗处理下为23.52%)，正常光照下最大值出现在0∶00(22.59%)，黑暗处理下最大值出现在16∶00(29.67%)。正常光照下2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯日变化在4∶00时出现高峰(6.07%)，其余时段相对含量变化平缓(2.50%～4.08%)，而黑暗处理下的则在1.69%～2.72%区间内波动。

表2 百里香叶片中芳香烃类挥发物相对含量日变化Table 2 Diurnal variation of relative content of aromatic hydrocarbon volatiles in Thymus mongolicus leaves

续表2

2.2.3黑暗处理对醇类挥发物相对含量日变化的影响 黑暗处理导致醇类挥发物相对含量日变化波动幅度减小，黑暗处理组的醇类挥发物相对含量变化范围为4.71%～14.18%，正常光照组的为5.39%～9.45%，黑暗处理组的变化范围是正常光照组的42.87%。正常光照下的醇类挥发物相对含量呈下降-上升-下降-上升的波动趋势，相对含量最大值为20∶00的14.18%，最低值为0∶00的4.71%。所有时段，黑暗处理的日变化趋势与正常光照的均相反，但变化幅度较小(5.39%～9.45%)。

在不同时间所有样本中均有检测到桉叶油醇。一天中正常光照下桉叶油醇相对含量的呈下降-上升-下降趋势，20∶00相对含量最高(11.58%)，0∶00相对含量最低(4.21%)，黑暗处理下的则在5.39%～9.45%间波动。

表3 百里香叶片中醇类挥发物相对含量日变化Table 3 Diurnal variation of relative content of alcohols volatiles in Thymus mongolicus leaves

续表3

2.2.4黑暗处理对酚类挥发物相对含量日变化的影响 正常光照下，8∶00-16∶00酚类相对含量变化幅度较小(1.00%～1.88%)，20∶00，4∶00释放较多(3.48%，4.52%)，0∶00酚类相对含量最低(0.01%)。黑暗处理下酚类挥发物相对含量日变化较小，各时段的均小于1.00%，且12∶00和16∶00时未在样本中检测到酚类挥发物。

正常光照下百里酚相对含量在4∶00，8∶00释放较多(1.40%，0.79%)，其余时间释放较少(0.00%～0.26%)，黑暗处理组中则未检测到其存在。香芹酚在正常光照组的所有样本中均有释放，日变化趋势与酚类挥发物的相同，黑暗处理组的仅在20∶00与4∶00释放。

表4 百里香叶片中酚类挥发物相对含量日变化Table 4 Diurnal variation of relative content of phenols volatiles in Thymus mongolicus leaves

2.2.5黑暗处理对酯类挥发物相对含量日变化的影响 正常光照下和黑暗处理下的百里香叶片中检测出的酯类挥发物相对含量均较少，日变化幅度也均不明显在0.00%～0.44%范围内波动。同时段正常光照的和黑暗处理的酯类挥发物相对含量存在差异。

正常光照下的百里香在6个检测时间中均释放了乙酸乙酯，12∶00相对含量最大，为0.27%，其余时间释放均较少，在0.02%～0.09%范围内变化。黑暗处理对乙酸乙酯日变化具有影响，黑暗处理的乙酸乙酯相对含量日变化呈先上升后下降趋势，在16∶00最大(0.07%)，4∶00与8∶00未检测出乙酸乙酯。

表5 正常光照下百里香叶片中酯类挥发物相对含量日变化Table 5 Diurnal variation of relative content of esters volatiles in Thymus mongolicus leaves

2.2.6黑暗处理对其它挥发物相对含量日变化的影响 其它挥发物都为相对含量较低、同类化合物较少的挥发物，无明显日变化趋势。其中，黑暗处理组中均有释放(3E2E)-2-亚乙基-6-甲基-3,5-二烯醛，20∶00含量最高(0.18%)，其余时间变化平稳(0.01%～0.08%)，正常光照的仅在12∶00和0∶00检出，相对含量分别为0.08%和0.24%。其他挥发物仅在极少的样本中被检测到，相对含量也较低。

表6 百里香叶片中其它挥发物相对含量日变化Table 6 Diurnal variation of relative content of other volatiles in Thymus mongolicus leaves

续表6

3 讨论

黑暗环境会影响影响各类挥发物的释放，但由于植物体内次生代谢途径多样，各类挥发物受黑暗影响的机理也不同[17-18]。植物次生代谢会产生多种萜类化合物，目前已发现近40 000种[19-20]，本研究中百里香释放的大部分烯烃类物质及芳樟醇、萜烯醇、桉叶油醇等部分烯烃含氧衍生物均为萜类化合物，释放的总的相对含量与总种数均较多，与刘敏等人对黑黄檀(DalbergiafuscaPierre)、降香黄檀(DalbergiaodoriferaT. Chen)的研究结果一致[21]。光照是植物进行生命活动的重要生态因子，萜类化合物的合成对光照也十分敏感[22]。本研究中，黑暗处理下百里香释放的烯烃类化合物的相对含量与种类数均小于正常光照，一方面是由于光照是影响光合作用的重要因子，光合作用是植物体内主要的供能反应，同时其产物也是许多次生代谢的前体物质，从能量与物质两方面都干扰着烯烃类化合物的合成[23-24]；另一方面光照会提高萜类相关合成酶基因的表达量，Kawoosa等人[25]对胡黄连研究发现光照下与萜类合成有关的pkhmgr和pkdxs酶表达量更高，使前体物质分配至萜类代谢途径更多。

芳香烃类挥发物是草莽酸代谢途径的重要产物。苯丙氨酸是草莽酸代谢途径的重要前体物质，在黑暗环境下会不断积累[26]，黑暗处理下百里香芳香烃类挥发物相对含量较光照的更高，变化幅度也较光照的更小。酚类物质在植物体内主要通过苯丙烷代谢途径产生，苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶和4-香豆酸-CoA联结酶是此途径的3个关键酶[27]。

光照会诱导苯丙烷代谢途径中苯丙氨酸解氨酶活性增强[28]，产生酚类物质，本研究中黑暗处理下的中百里香缺少光照的诱导，因而释放的酚类物质相对含量较低。此外，黑暗环境下无紫外线也是酚类化合物释放较少的重要原因，自然光中含有的紫外光会对植物细胞造成紫外线损伤，植物通过合成酚类化合物使到达细胞的紫外线减少从而减少损伤，已有研究发现山楂(CrataeguspinnatifidaBunge)和桃(AmygdaluspersicaL.)在紫外线照射后酚类化合物含量增加[29-30]。

植物释放总挥发物是次生代谢产生的各种挥发物的集合，其合成与释放具有日变化规律，但不同植物日变化趋势不同[31-32]。一天中百合(Liliumbrowniivar.viridulum)[10]、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)[33]等植物释放的挥发物数量呈先增加后降低的趋势，毛竹(Phyllostachysheterocycla(Carr.) Mitford ‘Pubescens’)[34]挥发物数量日变化趋势则表现为上升-下降-上升-下降。本研究发现，正常光照下百里香挥发物数量呈下降-上升-下降-上升趋势，低谷期为12∶00和0∶00，高峰期为8∶00。植物生物钟核心调控网络可以分为中心循环、早晨循环和傍晚循环[35]，本研究中黑暗处理下百里香在各时段挥发物数量均减少，且白天(8∶00，12∶00和16∶00)与夜间相比影响大，这可能是由于调控百里香挥发物释放的早晨循环受光照影响大，黑暗处理阻碍部分挥发物代谢，导致白天黑暗处理的比正常光照的挥发物数量减少，而傍晚循环受光照影响小，导致黑暗处理的与正常光照的挥发物数量相近。

4 结论

正常光照和黑暗环境下，百里香释放的挥发性物质主要为烯烃类、芳香烃类、醇类、酚类和酯类5大类，其中烯烃类挥发物数量与相对含量均明显高于其余类别的化合物。黑暗环境对于百里香挥发物数量日变化具有影响，减少了挥发物总数量，并且最大值与最小值出现时间发生改变。黑暗处理同样使各类挥发物相对含量最大值最小值出现时间改变，并且减小了挥发物相对含量日变化波动幅度。可见黑暗处理会对百里香挥发性物质的合成与释放产生影响。