异龄老芒麦根际土壤中脂肪酸类物质检测及根际土壤的自毒效应研究

杨 航，祁 娟，刘文辉，刘艳君，宿敬龙，李 明

(1. 甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中-美草地畜牧业可持续研究中心，甘肃 兰州 730070；2. 青海省畜牧兽医科学院，青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室，青海 西宁 810016)

自毒作用是导致连作障碍的主要因素之一[1]。植物在生长过程中，通过根系向土壤中释放一些有毒物质抑制自身或种内植物生长发育[2]，这些物质包括有机酸类、脂类、烃类、苯类等[3]。研究表明，兰州百合(Liliumdavidiivar. unicolor salisd)根系分泌物中鉴定出棕榈酸、抗氧化剂2246和高根二醇等物质[4]，且不同连作年限根际土壤浸提液会抑制百合幼苗的生长[5]；不同种植年限的紫花苜蓿(MedicagosativaL.)土壤中自毒物质的种类与含量有显著差异，且其水浸提液会对其种子萌发产生抑制作用[6,7]。马瑞霞等[8]利用气质联用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术从小麦(TriticumaestivumL.)残体中分离出酚酸类化感物质，亦对其种子萌发产生明显的抑制效果；聂铭[9]研究表明，种植地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)土壤中自毒物质含量随着种植年限的增长呈现出先增加后减少的趋势。

近年来，随着畜牧业的发展，饲草料缺乏问题日益显著，人工草地建植是解决畜牧业发展的关键途径[10]。老芒麦(ElymussibiricusL.)是禾本科披碱草属多年生牧草，具有抗逆性强、产草量高、适口性好等特点[11]，常用于人工草地的建植和退化草地的修复。但多年的实践证明，老芒麦的利用年限较短，有研究表明，披碱草属人工草地在建植第4年以后开始衰退，在封育条件下，种群生产力在第4年也会开始下降，第7年严重退化[12]，有研究表明连作会抑制植物的生长，致使植物生产力下降[13]。目前，关于调控老芒麦种群易衰退的主要因子研究偶见报道[14-16]，但关于连作障碍对老芒麦生长的影响研究鲜见报道。为此，本研究以不同种植年限‘青牧一号’老芒麦根际土壤为研究对象，通过GC-MS检测方法，分析老芒麦根际土壤中脂肪酸酯类物质的种类与含量变化规律，并进一步研究不同年限土壤浸提液对老芒麦种子萌发的影响，以明确连作障碍与自毒效应是否为影响老芒麦生长发育的因素之一，旨在避免自毒效应给老芒麦人工草地建植带来损失，同时为老芒麦人工草地建植提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概括

试验地位于青海省海北州海晏县国家草品种区域试验中心，坐标为100°85′E，36°45′N，平均海拔3 154 m。寒冷期长，无绝对霜期，最高气温31℃，最低气温-33℃，年均温0.6℃。年降水量集中在7，8，9月份，为369～403 mm，全年干湿季节分明，雨热同期，年均蒸发量在1 435 mm左右，无霜期约90 d。

1.2 根际土壤采集

于2019年9月初，在已建植3年、4年、5年和8年的‘青牧一号’老芒麦人工草地中分别挖取长势均匀的老芒麦根系，参照卢豪良等[17]方法，先抖落表面土壤，后用毛刷轻轻刷掉根表面大约5 mm的土壤，装入密封袋，写明标签，带回实验室冷藏保存。

1.3 脂肪酸提取

将所采集到的4种年限土壤晾干后研磨过0.25 mm筛，然后称取0.5 g至10 mL的离心管中，每个年限做3次重复，进行以下操作。

(1)每个离心管中加入5 mL的色谱甲醇浸泡2小时，10 000 r·min-1离心10 min，提取2次合并上清液。

(2)再加入5 mL的三氯甲烷混匀后浸泡2小时，10 000 r·min-1离心10 min，用注射器过滤，提取2次合并上清液。

(3)将步骤(1)(2)中的提取液各取2.5 mL至离心管中混匀，用氮吹仪吹干。

(4)在经过氮吹仪的离心管中加入5%氢氧化钾-甲醇溶液1 mL，摇匀，在60℃水浴加热30 min，取出冷却至室温。

(5)后加入3 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，摇匀，在60℃水浴加热3 min，取出冷却至室温。

(6)最后加入2 mL正己烷，充分振荡，静置，取上清液于GC-MS分析。

1.4 GC-MS分析条件

气象色谱仪：安捷伦7890A-5975CMS气相色谱质谱联用仪。安捷伦毛细管DB-225 ms(规格为30 m×0.25 mm×0.25 μm)。进样口温度：280℃，分流比 20：1；升温程序：初始温度为50℃，保持5℃·min-1升温至 200℃，再以2℃·min-1升温至230℃，保持10 min。载气：He，载气流量：1 mL·min-1；进样量1 μL。离子源温度为230℃，四级杆温度150℃，电离方式EI，电子能量70 eV，扫描质量范围为35～800 μ。

1.5 土壤浸提液制备

将所采集到的已种植老芒麦3，4，5和8年的根际土壤晾干后研磨过0.25 mm筛，分别称取5，10，20和50 g各年限根际土壤置于三角瓶中，加入100 mL蒸馏水，用保鲜膜封口，在30℃的超声波中萃取30 min，然后在25℃，150 r·min-1的条件下震荡浸提24 h，振荡完后过滤浸提液，最后将浸提液定容为100 mL，各年限根际土壤分别配置成50，100，200，500 g·L-1浸提液，于4℃保存备用。

1.6 种子发芽试验与测定指标

选取大小一致、饱满无病害的‘青牧一号’老芒麦种子，用78%的酒精浸泡1 min，然后用蒸馏水冲洗至无酒精味，用滤纸吸干表面水分。采用培养皿纸上发芽法，在直径为9 cm的一次性培养皿中铺双层滤纸，每个培养皿均匀摆放30粒老芒麦种子，加入上一步制备的土壤浸提液5 mL，共16个处理，3次重复。培养皿盖上盖子，置于温度为25℃，光强6 000 lx，相对湿度75%，光周期14 h，暗周期10 h的光照培养箱中，每天补充适量根际土壤浸提液保证滤纸湿润。

测定指标：参考祁娟等[18]方法，以胚根伸出种皮2 mm作为萌发标准，在发芽第5天测定发芽势，第12天测定种子发芽率，同时，每个处理随机选取10株幼苗，在坐标纸上测定胚芽和胚根长。用以下方法计算不同处理的种子发芽势和发芽率。

发芽势=发芽试验5天内供试种子的发芽数/供试种子数×100%；

发芽率=发芽试验12天内供试种子的发芽数/供试种子数×100%。

1.7 数据统计分析

利用SPSS 19.0软件对老芒麦种子发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长指标数据进行方差分析和显著性比较(P<0.05)，并对年限、浓度及其互作效应进行双因素分析，利用Microsoft Excel 2010进行综合处理和绘图。

2 结果分析

2.1 不同种植年限老芒麦根际土壤脂肪酸酯类物质的检测

对不同种植年限老芒麦根际土壤采用正丁烷提取法，提取物通过GC-MS分析，得到总离子流图(图1)，与标准物质谱图对比，若两者匹配度大于95%，即可鉴定出此物质。根据总离子流图，分析得到4种不同年限土壤的脂肪酸酯类物质含量(表1)。结果显示，4个不同年限的根际土壤中均检测出10种物质。就脂肪酸酯类物质总量而言，5龄老芒麦的根际土壤中相对含量较高，为50%，8龄中较低，为41%，3和4龄根际土壤中脂肪酸酯类物质总量分别为48%和45%。

硬脂酸甲酯是4个不同年限土壤中占比最大的物质，分别占3，4，5和8龄土壤中脂肪酸酯类总量的39%，42%，42%和41%，棕榈酸甲酯占脂肪酸酯类物质总量的29%，33%，31%和32%。3龄的根际土壤中，棕榈油酸甲酯、亚油酸甲酯和r-亚麻酸甲酯显著高于其他3个年限土壤(P<0.05)，其中，棕榈油酸甲酯较4，5和8龄土壤分别高出98%，62%和58%，亚油酸甲酯分别高出47%，17%和75%，r-亚麻酸甲酯分别高出51%，127%和217%。棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯含量会随着种植年限的升高呈现先升高后降低的趋势，且都在5龄的时候达到较大值，其棕榈酸甲酯含量显著高于8龄土壤(P<0.05)，较8龄土壤高出17%，硬脂酸甲酯含量较3，4和8龄土壤分别高出12%，10%和23%(P<0.05)。

2.2 不同种植年限老芒麦根际土壤浸提液对其种子萌发及幼苗生长的影响

2.2.1不同年限老芒麦土壤浸提液对其种子发芽率的影响 由图2可知，不同年限土壤浸提液与不同浓度浸提液处理会对老芒麦种子发芽率造成不同的影响，3龄老芒麦根际土壤浸提液在200 g·L-1的浓度下发芽率较高，为69%，在5龄且浓度为500 g·L-1的浸提液处理下发芽率较低，仅为45%；4龄老芒麦根际土壤浸提液下，发芽率会随着浸提液浓度的升高而先升高后下降，且500 g·L-1浓度下显著低于其他3个处理(P<0.05)；5龄老芒麦根际土壤浸提液处理下，发芽率随着浸提液浓度的升高而下降，50 g·L-1处理下显著高于200和500 g·L-1(P<0.05)，较100，200和500 g·L-1处理下发芽率分别提高了6%，27%和44%；在8龄老芒麦根际土壤浸提液处理下，发芽率同样随着浸提液浓度升高而下降，200和500 g·L-1浓度处理下显著低于50 g·L-1处理(P<0.05)，较50 g·L-1处理分别降低了17%和24%。在浸提液浓度为200 g·L-1处理下，发芽率会随着年限的增长而下降，3龄和4龄老芒麦根际土壤浸提液处理下显著高于5龄和8龄(P<0.05)。

图1 不同种植年限老芒麦根际土壤脂肪酸酯类物质GC-MS色谱图Fig.1 GC-MS map of fatty acid lipids in soil of rhizosphere soil of Elymus sibiricus L.in different planting years

表1 不同种植年限老芒麦根际土壤中脂肪酸酯类物质的相对含量Table 1 Relative contents of fatty acids and lipids in rhizosphere soil of Elymus sibiricus L. in different planting years

图2 不同种植年限老芒麦根际土壤浸提液对其种子发芽率的影响Fig. 2 Effects of soil extracts on seed germination rate of Elymus sibiricus L. in different planting years注：不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate significant differences between different treatments at the 0.05 level,the same as below

2.2.2不同年限土壤浸提液对老芒麦种子发芽势的影响 由图3可知，3龄老芒麦根际土壤浸提液在50 g·L-1浓度下发芽势较高，为49%，5龄老芒麦根际土壤浸提液在500 g·L-1的浓度处理下发芽势较低，值为30%。在5龄和8龄根际土壤浸提液处理下，老芒麦种子发芽势会随着土壤浸提液浓度的升高而呈下降趋势，且5龄老芒麦根际土壤在200 g·L-1和500 g·L-1处理下种子发芽势显著低于同龄50 g·L-1浸提液处理，分别降低了32%和37%(P<0.05)。土壤浸提液浓度为50 g·L-1时，3龄老芒麦根际土壤浸提液处理下种子发芽势较8龄提高了29%(P<0.05)；在200 g·L-1浓度下，老芒麦种子的发芽势随年限增长呈现出先降低后升高的规律，在5龄时最低，较3和4龄分别降低了26%和24%(P<0.05)。

图3 不同种植年限老芒麦根际土壤浸提液对其种子发芽势的影响Fig.3 Effects of soil extracts on seed germination potential of Elymus sibiricus L. in different planting years

2.2.3不同年限土壤浸提液对老芒麦胚芽长的影响 由图4可知，不同浓度与不同年限的土壤浸提液会影响老芒麦胚芽生长。4龄老芒麦根际土壤浸提液在100 g·L-1的浓度处理下老芒麦胚芽较长，达到5.6 cm，胚芽长在50 g·L-1的8龄老芒麦根际土壤浸提液处理下较短，为4.5 cm；3龄老芒麦根际土壤浸提液处理中，胚芽长随浓度升高先下降后升高，200 g·L-1浓度处理下较50，100和500 g·L-1处理分别降低了21%，15%和10%；在4龄老芒麦根际土壤浸提液处理中，胚芽长随浓度升高先升高后降低，500 g·L-1浓度处理较100 g·L-1浓度处理下降低了16%(P<0.05)。在浸提液浓度为200 g·L-1的处理下，老芒麦胚芽长度会随着年限增长而增长，3龄根际土壤浸提液处理显著低于4，5和8龄，而在500 g·L-1浓度处理下，随着年限的增长，胚芽长度降低。

图4 不同种植年限老芒麦根际土壤浸提液对其幼苗胚芽长的影响Fig.4 Effects of soil extracts on germ length of Elymus sibiricus L. in different planting years

2.2.4不同年限土壤浸提液对老芒麦胚根长的影响 由图5可知，3龄老芒麦根际土壤浸提液处理下，老芒麦幼苗胚根长会随着浓度的升高而下降，胚根长在500 g·L-1浓度处理下较其他3个浓度分别降低了28%，21%和17%(P<0.05)；8龄老芒麦根际土壤浸提液处理下，幼苗胚根长同样随着浓度升高而降低，浓度为500 g·L-1处理时，老芒麦胚根长较短，为2.7 cm，较50 g·L-1和100 g·L-1的浓度处理分别降低了25%和20%(P<0.05)。在浸提液浓度为100 g·L-1的处理下，老芒麦幼苗胚根长会随着年限的增长先降低后升高，在5龄根际土壤浸提液处理下较低，当浸提液浓度为200 g·L-1时，胚根长会随着年限增长而下降。

图5 不同种植年限老芒麦根际土壤浸提液对其幼苗胚根长的影响Fig.5 Effects of soil extracts on radicle length of Elymus sibiricus L. in different planting years

2.3 浸提液不同年限、浓度及其互作对种子萌发及幼苗生长影响的方差分析

表2双因素方差分析结果显示，年限与浸提液浓度对老芒麦种子的发芽率、发芽势、胚芽长和胚根长会产生显著或极显著影响，年限对种子发芽势与胚根长的影响不显著，对发芽率影响极显著(P<0.01)，对胚芽长影响显著(P<0.05)。而浸提液浓度对种子萌发与幼苗生长均存在极显著影响(P<0.01)，而浸提液年限与浓度的交互作用对发芽率、发芽势和胚芽长影响极显著(P<0.01)，对胚根长无显著影响。

表2 年限、浓度及其互作对种子萌发及幼苗生长影响的方差分析Table 2 Results of two-way ANONA of characteristics by years,concentrations and their interactions on seed germination and seedling growth

3 讨论

3.1 不同种植年限老芒麦根际土壤脂肪酸酯类物质含量变化

脂肪酸是根系分泌物的主要物质之一[19-20]，在许多植物中存在着多种脂肪酸类物质，并且植物连作年限会影响其物质的分泌和积累[21]，进而影响连作种植下自毒程度的强弱。郑阳霞等[22]研究表明，脂肪酸酯类物质会破坏西瓜幼苗的抗氧化系统，抑制幼苗的生长。本研究表明，种植老芒麦年限不同，其根际土壤中脂肪酸酯类物质含量存在差异，且棕榈酸甲酯、十七烷酸甲酯和硬脂酸甲酯含量随年限的升高呈现先升高后下降的规律，均在5龄时最高，这可能是老芒麦经过5年的种植后，植株内部生理代谢系统发生了改变，导致不同年限老芒麦分泌的化感物质含量具有差异，导致在第8年生长时，根系分泌的物质组分与含量发生变化；本研究结果还表明，5龄根际土壤中脂肪酸酯类物质的总含量是最高的，而在种植了8年的根际土壤中脂肪酸酯类物质总含量有所下降，说明老芒麦在多年的建植过程中，可能随着年限的增长，土壤中脂肪酸酯类物质的积累会达到一个峰值，从而影响老芒麦生长发育，使其根系分泌物减少，并结合土壤自身的缓冲性[23]，使第8年时土壤中脂肪酸酯类物质含量较低。有研究发现，当自毒物质的积累超过某个阈值，便会产生自毒效应使植株生长受阻，导致根系分泌物的种类和数量相对减少[24-25]，这与本试验结果相一致。

3.2 不同种植年限老芒麦根际土壤浸提液对其种子萌发及幼苗生长的影响

种子萌发期是植物生长的首要阶段，萌发期会对外界环境产生最敏感的响应，而且种子萌发会影响植株的出苗率和种群数量，幼苗则会直接影响植株的产量和品质[26]。杨倩等[27]在异龄苜蓿土壤浸提液对3种植物种子萌发的影响的研究中发现，5龄苜蓿根际土壤浸提液对其种子萌发的抑制作用强于3龄和9龄土壤；王英等[28]研究表明，不同浓度伊贝母根际土壤浸提液对其种子萌发存在浓度效应。本试验结果表明，老芒麦种子萌发在不同年限和不同浓度老芒麦根际土壤浸提液下表现存在差异。在不同年限下，低浓度的根际土壤浸提液对老芒麦种子萌发、胚芽长和胚根长产生的抑制效果不明显，表明了自毒物质可能要积累到一定的浓度水平才会产生抑制作用，这与胡跃高等[29]在苜蓿的自毒性研究中得到的结果相似。在5龄和8龄的根际土壤浸提液处理下，随着浸提液浓度升高，发芽势、发芽率和胚根长抑制作用逐渐增强，而胚芽长没有呈现这一趋势，一方面说明老芒麦不同部位对自毒物质响应有差异，另一方面也说明了老芒麦种植年限与浸提液浓度都是影响老芒麦种子发芽和幼苗生长的因素，这与张新慧等[30]在当归(Angelicasinensis(Oliv.) Diels)根际土壤水浸液的自毒作用研究及化感物质的鉴定试验中的研究结果相一致。在本试验中，浸提液浓度为200 g·L-1和500 g·L-1时，5龄根际土壤浸提液对种子发芽抑制作用最强，而8龄时抑制作用又有所减弱，这可能是因为老芒麦在种植2～4年期间植株生命力最旺盛，分泌的根系分泌物较多，在第5年时自毒效应反馈到老芒麦生长发育时期，导致根的发育受到抑制，根系分泌物从源头上减少，到第8年时根系分泌物被土壤自我调节或者对周围杂草产生化感效应而吸收，从而种植老芒麦8年的土壤浸提液对种子发芽的抑制作用低于5年土壤。王希[31]在黄土高原紫花苜蓿自毒效应的初步研究中同样发现，种植紫花苜蓿5年的土壤浸提液处理其种子，发芽率低于种植紫花苜蓿9年的土壤浸提液处理，这与本试验结果相一致。

从双因素方差分析可知，年限、浓度和年限与浓度的交互作用都会影响种子萌发和幼苗生长，表明老芒麦随着种植年限的增长，自毒物质在土壤中滞留、转化，在积累到一定浓度后，会制约老芒麦生长发育，导致老芒麦人工草地补播效果不明显。李玉占等[32]研究表明，苜蓿在5年后生产力下降，在间隔时间短的情况下，补播很难成功，其自毒效应可能是主要原因之一，这与本试验结果相一致。

综上，不同种植年限老芒麦土壤浸提液存在自毒作用，在5龄时表现突出。因此，可以推断老芒麦很可能存在连作障碍，并且自毒作用是连作障碍的主要原因之一，而自毒物质除了脂肪酸酯类物质，可能还存在成百上千种，这有待于更进一步研究。

4 结论

本研究表明，5龄老芒麦根际土壤中脂肪酸酯类物质的相对总含量较高，为50%；5和8龄老芒麦根际土壤浸提液对其种子发芽率具有明显的“低促高抑”浓度效应；在浸提液浓度为200 g·L-1时，年限增长与胚根长生长呈负相关；年限对种子发芽率影响极显著，对胚芽长影响较显著。因此推测，老芒麦逐渐衰退与自毒作用导致的连作障碍有密切的关系，怎样减弱自毒物质的毒害进而延缓老芒麦退化需要进一步研究。