紫红曲菌发酵薏米促α-生育酚富集及其发酵动力学模型构建

宋增光 曾海英 秦礼康 朱 怡 毛佳怡

(贵州大学酿酒与食品工程学院1，贵阳 550025)(贵州省植保植检站2，贵阳 550001)

紫红曲菌(Monascuspurpureus)是一种小型丝状腐生真菌，属红曲科(Monascaceae)、红曲霉属(Monascus)[1]是生产红曲的特征性微生物。由红曲霉菌发酵谷物粮食所得的红曲是我国传统的药食两用食物。紫红曲菌发酵过程中会产生多种有益的次级代谢产物，富含生育酚、谷维素、Monacolin K、γ-氨基丁酸、麦角固醇、天然植物激素等活性成分[2-4]，具有降脂、降压、抗氧化和调节机体代谢等功效[5,6]。

薏米是一种药食两用的杂粮，含大量营养成分，如多糖、薏苡素、薏苡酯、脂肪酸、多不饱和脂肪酸及多种氨基酸等。据报道薏米及其提取物具有抗氧化、抗癌、抑制肥胖、降血糖、抗炎等功效[7]。还具有降脂降糖、抗癌、抗氧化、抗过敏、提高免疫力等生理活性功能[8,9]。

Huang等[10]利用紫红曲菌固态发酵葛根和红曲米的混合基质，发酵后的异黄酮含量和色素强度均高于红曲米和葛根，且发酵混合物的DPPH、·OH、FRAP和总抗氧化活性也比葛根和红曲米具有更高的抗氧化能力，主要是由于发酵之后的色素强度和总酚的含量增加的原因。贺圣凌等[2]对红曲发酵薏苡糠亲脂化合物量变规律进行了探究，结果表明红曲发酵薏苡糠其亲脂性化合物主要为α-生育酚和γ-谷维素，且在发酵过程中，两者含量均明显增加。杨玉洁等[11]用红曲霉菌发酵不同杂粮优化后发现亲脂性化合物γ-谷维素含量比未发酵的增加了14倍。

本实验以薏米为发酵底物，以紫红曲菌(Monascuspurpureus3.4629)作为发酵菌种，以α-生育酚含量为评价指标，采用固态发酵工艺技术[12]，利用响应面优化发酵条件，并通过建立发酵动力学模型研究紫红曲菌固态发酵薏米产α-生育酚过程中菌体、产物、底物之间的动态定量关系，更准确地对参数进行预测[13]。通过利用实验室小规模实验获得数据设计大规模的发酵工艺过程[14]，为天然α-生育酚的富集提供新思路、新方法和新工艺，同时充分挖掘薏米资源的综合利用价值，提高其经济附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

薏米；紫红曲菌(Monascuspurpureus3.4629):中国普通微生物菌种保藏管理中心。

正己烷(色谱纯);α-生育酚标准品(纯度99.9%);其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器,HH-B11·600BY电热恒温培养箱,TCL-16B高速台式离心机,安捷伦1260高效液相色谱。

1.3 方法

1.3.1 发酵方法

1.3.1.1 紫红曲菌孢子悬浮液的制备

制备方法参考杨玉洁等[11]方法，并做适当改进。

1.3.1.2 紫红曲菌种子液的制备

制备方法和发酵方法参考杨玉洁等[11]方法，并做适当改进。

1.3.2 生物量测定

菌体量测定[15]: 固态发酵时菌丝和基质缠织在一起，直接计量生物量非常困难，一般通过间接法计量。由于氨基葡萄糖是参与构成真菌细胞壁中几丁质的主要成分，因此用氨基葡萄糖含量可以表征菌体量。

1.3.3 薏米紫红曲菌固态发酵条件优化

1.3.3.1 薏米紫红曲菌发酵工艺条件的单因素实验

以薏米为发酵底物，分别固定料液比(2∶1)、接种量10%、发酵时间10 d，发酵温度30 ℃。分别考察其料液比、接种量、发酵时间和发酵温度等单因素对薏仁红曲霉发酵产α-生育酚的影响，根据单因素实验结果和实际情况，选出对α-生育酚含量影响显著的因素进行响应面实验。

1.3.3.2 薏米紫红曲菌发酵工艺的响应面优化实验

综合发酵过程中各单因素对α-生育酚含量影响的实验结果，根据Box-Behnken实验设计原理[16]，选择对α-生育酚含量有显著影响的3个因素发酵温度(A)、接种量(B)、料液比(C)为自变量，以α-生育酚含量(Y)为响应变量，利用Design-Expert 7.0.0软件进行三因素三水平的响应面实验优化，实验因素和水平设计见表1。

表1 响应面实验因素与水平

1.3.4 分析检测

样品处理:发酵成熟杂粮基质冷冻干燥打粉后精确称取发酵物2 g，加入5 mL 色谱纯正己烷，振荡混匀，于60 ℃水浴锅中水浴20 min，8 000 r/min离心15 min，吸取上清液，如此采用正己烷反复提取3次，合并上清液层，利用旋转蒸发仪蒸干提取液，挥干物中加入1 mL 正己烷，超声使之溶解完全，8 000 r/min离心10 min，吸取上清液，过0.22 μm滤膜，入进样瓶。

色谱条件:色谱柱:硅胶柱(SUPELCOSILTM LC-SI)，25 cm×4.6 mm，5 μm。流动相:0.8%乙酸乙酯与 0.8%醋酸溶于正己烷。流速:1.5 mL/min。柱温:22 ℃。检测波长:290 nm。进样量:40 μL。

根据色谱条件对发酵薏米样品处理液进行HPLC上样分析，利用保留时间和光谱特征峰作为定性依据，采取峰面积归一法计算各组成的含量即外标法定量。

1.3.5 动力学模型建立

根据筛选得到的最佳发酵条件，建立紫红曲菌发酵薏米的菌体生长、产物生成和底物消耗动力学模型，利用紫红曲菌发酵薏米，每隔 2 d测定其生物量、α-生育酚含量及总糖消耗量，计算出动力学模型的参数，建立动力学方程，预测其在发酵过程中的变化。

1.3.5.1 菌体生长动力学模型的建立

发酵动力学的核心是关于菌体生长的动力学，生态学领域中描述在资源有限条件下种群增长规律的最佳数学模型是Logistic方程[17]。因此，Logistic方程[18]适合真菌的固态培养过程，其数学表达式为:

(1)

以t=0，X=Xm为初始条件，将式(1)积分变形后得式(2)，即:

(2)

式中:X0为菌体的初始生物量，以氨基葡萄糖量表征/OD/g；Xm为菌体的最大生物量/OD/g；μm为最大比生长速率/d-1；t为时间/d。

1.3.5.2 产物生成动力学模型的建立

产物生成速率与细胞生长速率之间的关系有三种类型:产物生成与菌体生长偶联型、产物生成与菌体生长部分偶联型及产物生成与菌体生长非偶联型[19,20]。紫红曲菌菌体生长与α-生育酚合成之间的关系为部分偶联型，因此，选择Leudeking-piret方程[21]作为合成动力学模型，见式(3)。

(3)

式中:P为产物浓度/mg/mL；X为生物量/OD/g；t为时间/d；a为与菌体生长相关联的产物合成常数；b为与菌体量相关联的产物合成常数。

将式(1)代入式(3)再积分得到式(4)。

P(t)=P0+c[X(t)-X0]+

(4)

1.3.5.3 底物消耗动力学模型建立

在发酵过程中，底物消耗主要有三个方面:菌体生长、细胞维持生命活动的消耗及生成代谢产物的消耗[22]。从发酵实验结果可知，底物消耗主要用于菌体生长和维持细胞代谢活动[23]。底物消耗动力学模型使用Dose Resp方程进行拟合[24,25]，模型见式(5)。

(5)

式中：S为底物浓度/g/mL；YX/S为菌体得率系数；YP/S为产物产率系数；Ke为维持系数。在紫红曲菌固态发酵产α-生育酚的过程中，底物不用于菌体的生长消耗，仅用于产物的合成，因此，为简化模型，式(5)可简化为:

(6)

S(t)=S(0)+gP(t)

(7)

再将式(4)代入式(7)中可得到底物消耗动力学拟合方程，见式(8):

(8)

1.3.6 数据处理与分析

所有实验数据取3 次重复实验的平均值，采用Origin 8作图，SPSS Statistics 17.0单因素差异性分析邓肯检验、Design-Expert 7.0.0响应面实验设计进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 薏米紫红曲菌发酵条件的单因素实验结果

2.1.1 发酵条件对α-生育酚含量的影响

由图1可知，α-生育酚含量随着发酵温度的变化呈先上升后下降的趋势。发酵温度为30 ℃时，菌体生长良好，α-生育酚含量最高，基质颜色呈紫红色，α-生育酚含量显著高于其他组(P<0.05)。

图1可知，当料液比为2∶1时，菌体生长良好，红曲颜色呈深红色，此时α-生育酚含量最高。料液比过高发酵热使得基质水分的散失，菌体的生长代谢受到限制，过低基质透气性不佳，红曲菌生长受阻，出现腐败现象。

接种量大小会影响菌体在培养基中的适应能力从而影响生长速度。适宜的接种量有利于微生物的生长代谢，有利于菌体的增长和次级代谢产物的积累。由图1可知，当接种量为10%时，α-生育酚含量最高，显著高于其他组(P<0.05)。

注:显著性分析字母加粗为温度，下划线为接种量，斜体为料液比。

2.1.2α-生育酚最佳收获期

由图2可以看出，α-生育酚含量随着发酵时间的延长呈先升高后平稳的趋势，第10天时达到最高(P<0.05)，10 d后α-生育酚的含量开始呈缓慢的下降趋势。梁爽等[26]利用红曲霉菌发酵籼米，确定收曲时间为9 d，此时桔霉素含量处于较高水平，糖化酶活力，色价均达到最高值。蒲立柠等[27]用紫红曲菌发酵青稞麸皮薏米基质时发现，产物的最佳收获期为12 d左右。发酵时间越长，基质营养物质消耗殆尽，大量菌体生长受到抑制或死亡，可能出现恶性厌氧发酵，使α-生育酚结构受到破坏，产量下降。综合考虑，发酵时间为10 d左右为宜。

图2 α-生育酚最佳收获期

2.2 薏米紫红曲菌发酵条件的响应面实验结果

在单因素实验基础上，采用中心组合实验设计，选择对α-生育酚含量影响较大的因素:发酵温度(A)、接种量(B)、料液比(C)为自变量，固定发酵时间10 d，根据Box-Behnken设计方案进行优化实验，各因素的实验组合及结果见表2。

由表2可看出优化后的实验结果α-生育酚的产量较优化前显著增加，0水平和1水平对α-生育酚的产量有促进作用，实验号5、7、10、15四组0水平条件下α-生育酚产量差异不大，误差较小。

表2 响应面实验设计与结果

2.2.1 数学模型的建立

利用Design-Expert 7.0.0软件对表2中的实验结果进行回归分析，得到二次回归模型方差分析结果见表3。对表3中数据进行二次多项回归拟合，得到α-生育酚含量(Y)对发酵温度(A)、接种量(B)、料液比(C)的二次多项式回归方程如下:

Y=12.61+1.99A+2.06B-2.19C-0.25AB+0.24AC-0.15BC-3.03A2-2.89B2-3.06C2

由表3回归模型系数显著性检验结果可知:模型的一次项A、B、C影响极显著(P<0.01)。二次项A2、B2、C2影响极显著(P<0.01)，交互项AB、BC、AC影响不显著，表明温度、接种量、料液比对α-生育酚含量交互影响作用不显著。

表3 二次回归模型方差分析

2.2.2 响应面分析结果

根据Design-Expert 8软件响应面分析，可从回归模型中得到最优工艺条件:料液比2∶1、接种量15%、发酵温度28 ℃、发酵时间10 d。在该优化条件下，α-生育酚含量的理论值为12.413 6 mg/mL，验证实验得出α-生育酚含量达12.067 mg/mL，与预测值接近，说明响应面法对紫红曲菌发酵薏米工艺条件的优化是可行的。

2.3 紫红曲菌发酵薏米动力学拟合结果

2.3.1 紫红曲菌固态发酵薏米动力学曲线

紫红曲菌固态发酵薏米，发酵过程测定总糖含量、生物量(氨基葡萄糖含量表征)和α-生育酚的含量，结果如图3所示。可以看出紫红曲菌生长和α-生育酚合成均呈S型曲线，在接种后紫红曲菌生长有一段2 d的适应期，菌体量增长缓慢，α-生育酚的合成缓慢，总糖消耗加速，之后进入快速增长期，在8～10 d进入稳定期，10 d时菌体量和α-生育酚的含量都达到最大值，紫红曲菌已长满整个薏米培养基，且颜色呈紫红色，此后进入衰亡期，菌体生长，产物富集开始缓慢减少，总糖消耗趋于完全。

图3 紫红曲霉生长和α-生育酚合成曲线图

2.3.2 菌体生长动力模型拟合结果

在软件 Origin 8.6 中输入式(2)的自定义函数，对菌体生物量的实验值进行非线性拟合，计算各参数的值从而得到动力学方程。由实验值得到Xm=0.55 OD/g，经拟合可得X0(a)=0.051 OD/g，μm(b)=0.578 9 d-1，代入式(2)中得到菌体生长动力学方程为:

R2=0.954 2

图4 菌体生长动力学模型拟合曲线

2.3.3 产物生成动力模型拟合结果

利用 Origin8.6 软件建立式(8)的自定义函数，对产物含量的实验值进行非线性拟合，计算各参数的值从而得到动力学方程.可得P0(e)=-0.577 7 mg/L，c=15.812 6，d=1.017，代入式(8)中得到产物合成动力学方程为:

R2=0.949

图5 产物生成动力学模型拟合曲线

2.3.4 底物消耗动力学模型拟合结果

利用 Origin8.6 软件建立式(8)的自定义函数，对底物含量的实验值进行非线性拟合，计算各参数的值从而得到动力学方程。可得f=3.6，g=-0.38代入式(8)中得到总糖消耗动力学方程为:

R2=0.125

图6 底物消耗动力学模型拟合曲线

根据动力学模型拟合结果可以看出:紫红曲菌发酵薏米动力学实验值与模型拟合值较为吻合，R2拟合度良好，模型极显著，能准确反映紫红曲菌发酵薏米过程中菌体生长、产物合成以及底物消耗的动态变化规律。目前紫红曲菌固态发酵动力学研究甚少，通过发酵动力学模型可以看出α-生育酚的合成为生长部分偶联型，生物量与产物合成成正比，菌体生长动力学确定紫红曲菌发酵薏米的生长快速增长期为4～8 d。利用快速增长期，不断补充底物延长快速增长期使之实现连续发酵，或者利用快速增长期4～6 d的菌体制作种子，缩短适应期达到缩短生产周期，进一步促进产物的富集，对于工业化生产具有实际指导意义。

3 结论

以紫红曲菌发酵薏米基质，通过单因素实验和Box-Behnken响应面优化实验得出紫红曲菌固态发酵薏米产α-生育酚的最佳条件为料液比2∶1、接种量15 %、发酵温度28 ℃、发酵时间10 d，此条件下α-生育酚含量最高，为12.413 6 mg/mL，验证实验得出α-生育酚含量达12.067 mg/mL，与预测值接近，优化可行。通过建立菌体生长动力学、产物生成动力学和总糖消耗动力学模型，模拟发酵过程中菌体、产物、底物之间的相互关系和动态变化过程，发酵动力学模型的预测值和实测值拟合效果良好，所建模型能较好反映紫红曲菌发酵薏米过程中的动力学变化。