两步水解法制备玉米抗氧化活性肽及产物的稳定性

王晓杰 刘晓兰 曲 悦 夏春荣 Stanislav Sukhikh Anna Аndreyeva

(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，齐齐哈尔 161006)(康德波罗的海联邦大学生命系统研究所微生物学和生物技术实验室，加里宁格勒 236016)

玉米肽是玉米醇溶蛋白经蛋白酶水解或微生物发酵后获得的低分子量产物。与玉米醇溶蛋白相比，玉米肽的水溶性显著增加，而且具有多重生物活性，包括抑制血管紧张素转换酶[1]、促进乙醇代谢[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、抗癌[5]等，在食品工业具有潜在的应用价值。

目前，在玉米抗氧化活性肽制备过程中，优先选择碱性蛋白酶Alcalase进行酶解[6]，其添加量一般在1%～4%(酶底比)范围内[7-9]，有的甚至高达到9.13%[10]。由于商用酶制剂价格偏高，大大提高了玉米肽的生产成本，制约了玉米肽的工业化生产和产品推广。

大麦芽由大麦经浸泡、发芽和热风干燥(水分4%～5%)制成[11]。在大麦芽中已经发现40多种内切蛋白酶，包括四种常见的蛋白酶类型，分别是天冬氨酸类蛋白酶、半胱氨酸类蛋白酶、丝氨酸类蛋白酶和金属类蛋白酶[12]。根据蛋白酶对蛋白质的催化部位，大麦芽中的蛋白酶可以分为内肽酶、羧肽酶、氨肽酶、二肽酶等[13]。在啤酒酿造工业，这些蛋白酶可以消化大麦醇溶蛋白以及其他大麦蛋白以增加蛋白质的溶解性；在中医领域，作为助消化的辅助药物而广泛应用。但是，还鲜有将麦芽粉作为蛋白酶制剂应用于玉米肽的制备中。

为解决玉米肽制备过程中商业酶制剂用量偏高的问题，本研究采用麦芽粉和碱性蛋白酶Alcalase对玉米醇溶蛋白进行两步水解，首先利用麦芽粉中蛋白酶的水解作用将玉米醇溶蛋白的高级结构破坏，将埋藏在分子内部的活性位点暴露出来，为第二步酶解创造有利条件，在保证酶解效率的同时，降低第二步商业酶制剂的使用量；研究玉米抗氧化活性肽的稳定性，为玉米抗氧化活性肽的工业化生产及开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米醇溶蛋白，自制麦芽粉。

碱性蛋白酶Alcalase(6.28 × 105U/mL)；硫代巴比妥酸、菲洛嗪；氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、2-脱氧-D-核糖、蓝色葡聚糖2000、aprotinine、杆菌肽。

1.2 仪器与设备

PC/PLCLD-53真空冷冻干燥机，NDA 701全自动凯氏定氮仪，TDL-5-A离心机，Purifier100蛋白质纯化色谱仪，DF-1集热式磁力加热搅拌器，Superdex Peptide 10/300 GL凝胶层析柱，pB-10 pH计，TU-1901双光束紫外可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 麦芽粉的制备

用小型粉碎机在转速16 000 r/min、时间10 s的条件下反复多次将大麦芽磨成粉末，磨粉过程时刻注意温度的变化，防止温度过高使蛋白酶变性。粉碎后过80目筛，得到麦芽粉，在干燥条件下保存。根据GB/T 28715—2012测定麦芽粉的蛋白酶总活力为(268.27±6.11)U/g。

1.3.2 玉米醇溶蛋白两步酶解法条件的优化

麦芽粉的第一步酶解：取10 g玉米醇溶蛋白放于250 mL烧杯中，加入蒸馏水配制成底物浓度10%的悬浮液，调节pH至5.5。按酶底比30%加入麦芽粉，搅拌均匀，加入大小合适的转子后，将烧杯放入50 ℃水浴磁力搅拌器中央，开始第一步水解反应。水解过程中通过滴加0.5 mol/L NaOH使pH维持在5.5，水解3 h后获得第一步酶解液。

碱性蛋白酶Alcalase的第二步酶解：调节第一步酶解液pH至8.5，温度至60 ℃，加入碱性蛋白酶Alcalase开始酶解反应，酶解过程中通过不断滴加0.5 mol/L NaOH使pH维持在8.5，在酶解0、0.5、1、1.5、2 h时分别取样2 mL装入离心管，放入沸水浴中灭酶5 min。4 000 r/min离心10 min后取上清液用于测定可溶性蛋白含量和抗氧化活性。

通过水解度、可溶性蛋白含量及抗氧化活性三个指标的综合比较，确定第二步Alcalase酶解的最适酶底比、底物浓度和水解时间。三个因素的实验范围为：酶底比：0.5%、0.75%、1.0%；底物浓度：7.5%、10%、12.5%；水解时间：1、2、3、4、5、6、7、8 h。

1.3.3 蛋白质含量的测定

可溶性蛋白含量采用Folin-酚法测定[14]，总蛋白含量采用微量凯氏定氮法测定。

1.3.4 水解度的测定

采用pH-stat法[15]。

1.3.5 抗氧化活性的测定

检测指标包括羟基自由基清除活性和亚铁离子螯合能力，测定方法参照文献[16]。

1.3.6 分子质量分布的测定

将样品溶解在含有0.15 mol/L NaCl的pH 7.0的磷酸盐(PBS，0.02 mol/L)缓冲液中，配置成蛋白质浓度为2 mg/mL的溶液。4 ℃、10 000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm微孔滤膜进行过滤。上样体积100 μL，流速0.25 mL/min，检测波长214 nm。色谱柱用含有0.15 mol/L NaCl的pH 7.0的PBS(0.02 mol/L)缓冲液进行平衡和洗脱。色谱柱用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，用标准蛋白(aprotinine，6 500 u；杆菌肽，1 400 u；氧化型谷胱甘肽，612 u；还原型谷胱甘肽，307 u)进行校正。标准蛋白分子量对数lgMr与有效分配系数Kaw的线性回归方程为y=-3.734 7x+4.815 3，R2=0.982。

1.3.7 玉米抗氧化活性肽稳定性的研究

考察pH、温度和冻融次数对玉米抗氧化活性肽稳定性的影响。用pH分别为3、5、7、9、11的缓冲液将样品配制成蛋白质浓度为2 mg/mL的溶液，在25 ℃下保温60 min后测定羟基自由基清除率和亚铁离子螯合率，表征pH对玉米抗氧化活性肽稳定性的影响。

将样品配制成10 mL、2 mg/mL的溶液，分别在4、25、37、100 ℃下放置2 h，通过测定羟基自由基清除率和亚铁离子螯合率，表征玉米抗氧化活性肽的热稳定性。

将样品配制成10 mL、2 mg/mL的溶液，测定-20 ℃冷冻24 h，25 ℃解冻1 h(反复冻融0、1、2、3、4、5次)时玉米肽的羟基自由基清除率和亚铁离子螯合率，表征玉米抗氧化活性肽的贮藏稳定性。

1.3.8 数据处理

每个实验平行3次，所有数据均以平均值±标准差表示，用SPSS Statistics 19.0进行统计学分析。采用Duncan检验进行差异显著性分析，P<0.05为差异显著性水平。

2 结果与讨论

2.1 玉米醇溶蛋白两步酶解法的条件优化

2.1.1 最适酶底比的确定

第一步采用麦芽粉水解3 h，不灭酶直接加入碱性蛋白酶Alcalase进行第二步酶解，在反应初始pH 8.5、温度60 ℃、底物浓度10%、时间2 h的条件下，研究不同酶底比对水解度、可溶性蛋白含量及产物抗氧化活性的影响，结果如图1所示。在麦芽粉酶解3 h基础上，加入Alcalase继续酶解，随着水解时间的延长和加酶量的增加，水解度和可溶性蛋白含量逐渐增大。这是因为在底物浓度一定的条件下，酶促反应速率和酶浓度成正比，随着酶添加量增加，水解速率加快，水不溶性的玉米醇溶蛋白在蛋白酶的作用下逐渐被切割成小分子肽段，使可溶性蛋白含量增加。但当酶底比由0.75%增加至1%时，水解度和可溶性蛋白含量之间差异不显著(P>0.05)，可能是因为当酶底比超过0.75%时，酶相对过量，引起了底物的竞争性抑制[17]，阻碍了酶与底物的结合。

注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)，余同。

酶底比0.75%制备的玉米肽具有更高的抗氧化活性，可能是因为不同加酶量影响了水解产物中的肽段长度及结构[18]，进而影响了玉米肽的抗氧化活性。在酶底比1%时，玉米醇溶蛋白酶解效率高，随着水解度的增大，具有抗氧化活性的多肽继续水解为无抗氧化活性的短肽或游离氨基酸，导致清除羟基自由基和螯合亚铁离子的能力降低。而酶底比为0.5%时，由于酶解效率低，导致具有抗氧化活性的玉米肽产量较少。两步水解法是为了利用麦芽粉的初步消解作为而降低Alcalase的使用量，同时制备出高抗氧化活性的玉米肽，因此，确定Alcalase的最适酶底比为0.75%。

2.1.2 最适底物浓度的确定

第一步采用麦芽粉水解3 h，不灭酶直接加入碱性蛋白酶Alcalase进行第二步酶解，在反应初始pH 8.5、温度60 ℃、酶底比0.75%、时间2 h的条件下，研究不同底物浓度对水解度、可溶性蛋白含量及产物抗氧化活性的影响，结果如图2所示。在不同底物浓度条件下，玉米醇溶蛋白的水解度之间无显著性差异(P>0.05)，但对可溶性蛋白含量和抗氧化活性影响较大。在整个水解期间内，当底物浓度由7.5%增加至10%时，可溶性蛋白含量、羟基自由基清除率和亚铁离子螯合率均增大，但是继续增加底物浓度，可溶性蛋白含量和抗氧化活性均降低。底物浓度低于10%时，可溶性蛋白含量的提高可归因于Alcalase对底物的有效消化，从而产生更多具有抗氧化活性的玉米肽。但随着底物浓度的继续增加，底物和酶的扩散率均降低[19]，且底物相对过量，Alcalase无法完全消化底物，导致玉米醇溶蛋白消化效率降低，抗氧化活性玉米肽的生成量减少，抗氧化活性降低。因此，选择最适的底物浓度为10%。

图2 底物浓度对玉米醇溶蛋白酶解效率及产物抗氧化活性的影响

2.1.3 最适水解时间的确定

第一步采用麦芽粉水解3 h，不灭酶直接加入碱性蛋白酶Alcalase进行第二步酶解，在反应初始pH8.5、温度60 ℃、酶底比0.75%、底物浓度10%的条件下，研究水解时间对水解度、可溶性蛋白含量及产物抗氧化活性的影响，结果如图3所示。随着水解时间的延长，水解度和可溶性蛋白含量均呈逐渐增加的趋势。第一步酶解时，麦芽粉中蛋白酶的水解作用可以将玉米醇溶蛋白的高级结构破坏，降低底物空间位阻的同时，将埋藏在分子内部的Alcalase的催化位点暴露出来。加入Alcalase进行第二步酶解时，由于加酶量低，所以酶切速度较慢，酶切反应持续进行，水解度持续增加，产生了更多的可溶性蛋白。随着水解时间的延长，水解产物的羟基自由基清除率和亚铁离子螯合率均呈先升高后降低的趋势。玉米肽的抗氧化活性与其肽段长度、构象以及氨基酸组成等因素有关[16]，随着水解时间延长，Alcalase持续水解，影响了水解产物中肽段的氨基酸组成和构象，进而影响了玉米肽的抗氧化活性。

图3 水解时间对玉米醇溶蛋白酶解效率及产物抗氧化活性的影响

综合分析，确定Alcalase的最适水解时间为6 h。在此条件下，水解度、可溶性蛋白含量、羟基自由基清除率及亚铁离子螯合率分别为24.53%、33.43 mg/mL、30.59%、38.32%。此时的水解度和可溶性蛋白含量与Jin等[7]采用Alcalase(2%)水解玉米蛋白粉75 min的效果相当。

2.2 玉米醇溶蛋白水解产物分子质量分布的测定

食物和动物来源的抗氧化活性肽通常含有2～30个氨基酸残基，分子质量为500～1 800 u，该范围内的肽通常具有较高的抗氧化活性，而且容易被人体消化吸收[20,21]。将样品配制成2 mg/mL的溶液，测定在麦芽粉水解3 h基础上，碱性蛋白酶Alcalase继续水解2、4、6 h时水解产物的分子质量分布，洗脱图谱见图4～图6。

图4 麦芽粉水解3 h+Alcalase水解2 h时样品的凝胶层析洗脱图谱

图5 麦芽粉水解3 h+Alcalase水解6 h时样品的凝胶层析洗脱图谱

由图4可以看出，在麦芽粉水解3 h基础上，加入Alcalase继续水解2 h，水解产物的分子质量主要分布在6 500～840 u和840～300 u范围内。随着Alcalase水解时间的延长，水解产物的洗脱图谱逐渐向右移动，分子质量逐渐变小。在Alcalase继续水解4 h时，分子质量6 500～882 u组分的含量减少了5.18%，而分子质量<300 u组分的含量增加了5.29%，可能是在麦芽粉中存在的羧肽酶和氨肽酶等催化下，导致水解产物中游离氨基酸含量增加；在Alcalase继续水解6 h时，水解产物的分子量主要分布在300～6 500 u范围内。从分子质量分布角度看，在麦芽粉的基础上，Alcalase继续水解，将玉米醇溶蛋白酶解成低分子量的肽段，也证明两步酶解效果更显著。另外，麦芽粉中存在的羧肽酶和氨肽酶，还可以将玉米肽链末端的疏水性氨基酸水解掉，进而降低玉米肽的苦味，这还需要进一步的研究证实。

2.3 玉米抗氧化活性肽稳定性的研究

2.3.1 pH对玉米抗氧化活性肽稳定性的影响

将玉米肽溶解在不同pH缓冲液中，研究不同pH对玉米肽羟基自由基清除率和亚铁离子螯合率的影响，以表征玉米抗氧化活性肽的酸碱稳定性，结果见图6。与对照相比，pH对玉米肽的羟基自由基清除能力没有显著性影响(P>0.05)，而对亚铁离子螯合能力产生极显著性影响(P<0.01)。在pH 3～5的条件下，玉米肽不具有亚铁离子螯合能力；在pH 7时，螯合能力与对照相当；在碱性环境中(pH>9)螯合能力极显著增加(P<0.01)，尤其是pH 11时，螯合能力达到64.48%。蛋白质和肽的金属螯合能力可以通过与带电荷氨基酸残基之间的静电相互作用完成[22]。随着pH值的变化，溶剂介质中的氢离子浓度发生变化，影响了玉米肽的带电荷性质，进而影响了玉米肽的亚铁离子螯合能力。因此，将玉米抗氧化肽应用于食品工业时，应该选择保持其高抗氧化活性的制备条件，可以制备成弱碱性食品。

图6 不同pH对玉米肽抗氧化活性的影响

2.3.2 温度对玉米抗氧化活性肽稳定性的影响

在浓度为2 mg/mL，pH为9.0的条件下，研究不同温度对玉米肽抗氧化活性的影响，以表征玉米肽的热稳定性，结果如表1所示。与25 ℃相比，4 ℃不能破坏玉米肽的抗氧化活性，而37、100 ℃对玉米肽的抗氧化活性起促进作用，说明玉米肽的抗氧化活性具有一定热稳定性，这与前人报道相一致[23]。可能是因为玉米抗氧化肽的空间结构简单，主要具有肽链一级结构及少量的二级结构，高温处理没有导致肽链断裂，仅使肽链部分二级结构展开，暴露一些活性位点于分子表面，从而使玉米肽的抗氧化活性增大。因此，在食品工业中，玉米抗氧化活性肽可以耐受一定时间的高温处理。

表1 处理温度对玉米肽抗氧化活性的影响

2.3.3 冻融次数对玉米抗氧化活性肽稳定性的影响

在质量浓度为2 mg/mL，pH为9.0的条件下，研究不同冻融次数对玉米肽抗氧化活性的影响，以表征玉米抗氧化活性肽的贮藏稳定性，结果如图7所示。与对照相比，随着冻融次数的增加，玉米肽的羟基自由基清除率和亚铁离子螯合率均呈现出稳定状态，说明玉米抗氧化活性肽具有良好的贮藏稳定性。可能是因为玉米抗氧化活性肽的空间结构简单，实验采用的反复冻融条件对肽的氨基酸组成和构象没有影响，进而玉米肽的抗氧化活性没有受到损失。

图7 冻融次数对玉米肽抗氧化活性的影响

3 结论

采用蛋白酶酶系丰富的麦芽粉和酶解效率较高的碱性蛋白酶Alcalase对玉米醇溶蛋白进行两步水解，确定了两步水解法制备高抗氧化活性玉米肽的最适条件为：第一步麦芽粉水解，在底物浓度10%、pH 5.5、温度50 ℃、酶底比30%条件下水解3 h；第二步Alcalase酶解，在底物浓度10%、pH 8.5、温度60 ℃、酶底比 0.75%条件下水解6 h。同时，玉米抗氧化活性肽具有热及贮藏稳定性，在中性和碱性条件下稳定，但不耐受酸性条件。两步水解法既降低了商品用酶制剂的用量，又保证了产物的抗氧化活性，为制备高抗氧化活性玉米肽及其在食品工业中的应用提供了参考。