续断种子方对少精子症模型小鼠精子发生的影响❋

何 明，王权胜，蒙帅杰，蒋 越，王东珊，杨德芬

(1. 广西中医药大学， 南宁 530001； 2. 广西中医药大学第一附属医院， 南宁 530023)

据统计资料显示，约50%的不孕不育由男方原因引起[1]。男性不育的原因很多，如生精功能障碍、输精管梗阻、附件腺功能缺陷、遗传或环境因素等[2-3]，其中生精功能障碍是男性不育的主要原因[4]。精子发生是一个极其复杂的过程，主要可分为有丝分裂期、减数分裂期和生殖期3个阶段。生精细胞凋亡和分化在精子发生过程中发挥着重要作用[5]。细胞增殖和凋亡之间的动态平衡决定了睾丸曲细精管中的细胞数量。在精子发生的整个过程中受到一系列激素的影响，其中睾酮在精子发生过程中起重要作用，精子发生缺乏睾酮会导致精子生成不足[6]。“续断种子方”源于明·岳甫嘉《医学正印》“补肾健脾益气种子煎方”。前期研究表明，续断种子方对精子具有抗氧化酶活性和减少氧化损伤作用，可提高精子质量[7-8]，是改善男性精子质量的有效药物，但其潜在的机制尚不清楚。因此，本实验基于精子发生的睾丸微环境，探索续断种子方对生精功能障碍模型小鼠精子发生的调节作用及其机制。

1 材料

1.1 主要仪器

MACRO精子计数板和WLJY-9000型伟力彩色精子质量检测系统(购自北京伟力新世纪科技发展有限公司)；TDL-4ZB型低速自动平衡离心机(购自湖南星科科学仪器有限公司)；扫描电子光学显微镜，由广西中医药大学第一附属医院病理科提供。

1.2 主要试剂与药物

环磷酰胺粉针剂(批号K1625007，购自阿拉丁公司)；TUNE试剂盒(产品号11684817910, 购自北京中杉金桥生物技术有限公司)；血清睾酮放射免疫试剂盒(批号S10940111，购自天津九鼎医学生物工程有限公司)。

续断种子方药物组成：续断15 g,杜仲 15 g,骨碎补15 g,菟丝子15 g,牛膝15 g,枸杞子10 g,女贞子10 g,党参15 g,白术10 g,山药15 g。采用单味中药配方颗粒(免煎中药，由江苏省江阴市天江药业有限公司生产，产品批号1203002)，维生素E胶丸，生产厂家为桂南药业股份有限公司(产品批号VE180402)。

1.3 动物

45只雄性小鼠，6～8周龄，体质量24～28 g，购自广西医科大学实验动物中心，动物许可证号[SCXK(桂)2009-0002]。小鼠饲养于广西中医药大学动物房，均自由采食饮水，隔日换水，3 d更换1次垫料，环境温度20～25 ℃，12 h明暗周期。适应性饲养1周后随机选取10只作为正常对照组，另外35只造模成功后按照随机数字表法分为模型组、续断种子方组、维生素E组各10只。本实验已通过广西中医药大学实验动物伦理委员会审查(批准号2017JJA10462)。

1.4 造模方法

模型的制备方法参考文献[9]，除对照组以外的小鼠均采用环磷酰胺以0.9%生理盐水5 ml稀释后，分别按2 mg/d[80 mg/(kg·d)]的剂量造模，连续腹膜内注射5 d。此法先前已被证明可诱导精子发生功能障碍[10]。同时对照组注射等量0.9%生理盐水。各组小鼠正常喂养4周后，随机抽取模型组小鼠5只处杀,取下左侧睾丸及附睾，光学显微镜下附睾精子检测和组织病理学中见少量精子，提示少精子症动物模型造模成功。

2 方法

2.1 干预方法

造模成功后称动物体质量，按人体等效剂量将药物配成水溶液剂型灌胃给药。模型组和对照组小鼠给予0.9%生理盐水灌胃；续断种子方组小鼠每天给予9 g生药量/(kg·d)，浓度为1 g/ml的续断种子方溶于生理盐水中灌胃，维生素E组小鼠(黄油溶液)每天给予75 mg/(kg·d)，浓度为5 mg/ml的维生素E胶囊溶于生理盐水中灌胃，每日1次，连续8周。

2.2 取材方法

末次给药24 h后将小鼠称重，各组所有小鼠行标本眼眶采血检测血清睾酮。然后头颈脱臼法处死小鼠迅速取出睾丸和附睾，生理盐水冲洗，除去血液将睾丸或附睾的质量除以体质量计算睾丸、附睾相对质量用于评价小鼠生长发育状态。将小鼠一侧睾丸和附睾分别固定于Bouin溶液中24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡切片包埋，行HE染色。另一侧附睾置于含2 mL培养液小皿中剪碎, 36.5 ℃孵育使精子充分游离泳动30 min,做精液质量分析。

2.3 精液全自动检测

采用精子计数板和精子检验系统检测精子浓度和活动力,按WHO《人类精液检查与处理实验室检验手册》[11]标准测定精子参数。

2.4 放射免疫法检测

将血清以3000 r/min分离15 min，取上清液置于-40 ℃冰箱，采用睾酮测定试剂盒对血清睾酮水平进行检测。

2.5 HE染色

睾丸和附睾组织切片行苏木精伊红(HE)染色,每组制作10张切片,每张切片随机取2个视野观察(×200,即每组观察20个视野),计数类圆形生精小管上皮层次、类三角形或类菱形间质细胞团内细胞数。记录显示严重低细胞性(生精细胞数减少)和生精上皮变薄的受损小管，附睾组织(×400, 每组观察20个视野)观察附睾管精子浓度和早熟精子数量。

2.6 TUNEL法检测

按试剂盒说明书操作,显微镜下生精细胞核和细胞质中染成棕黄色颗粒者为细胞凋亡阳性表达,每组制作5张切片,每张切片随机取5个视野观察(×100,即每组观察25个视野),计数生精细胞凋亡阳性率。每张切片计数每个生精小管内凋亡阳性细胞各占所有生精细胞的比率(即凋亡阳性率),连续观察5个生精小管断面计数凋亡阳性率。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 造模后体征和行为表现

小鼠出现饮水和进食减少、自主活动减少、毛发干枯、精神不振、耳廓苍白、上睑下垂无力、反应迟钝等症状，1周后上述症状逐渐好转。在造模中因体质量和剂量计算误差出现死亡2只(模型组1只，续断种子方组1只)，灌胃过程中因血管破裂、刺破胃及食管等原因致大鼠死亡2只(维生素E组1只，模型组1只)。

3.2 续断种子方对小鼠体质量、睾丸附睾相对质量、精子质量、生精小管受损的影响

表1示，生殖器官的相对质量和精子参数是常用于监测男性生殖系统的损害指标。与对照组比较，模型组小鼠睾丸相对质量、精子浓度和精子活力显著下降，受损生精小管增加(P<0.01)；与模型组比较，续断种子方组小鼠睾丸相对质量、精子浓度和精子活力显著增加，受损生精小管减少，差异有统计学意义(P<0.01)，体质量、附睾相对质量无明显变化。

表1 续断种子方对小鼠体质量、睾丸附睾相对质量、精子质量、生精小管受损的影响

3.3 续断种子方对小鼠血清睾酮、间质细胞、生精上皮层数的影响

表2示，与对照组比较，模型组血清睾酮、生精上皮层数显著降低(P<0.01)，间质细胞数值变化不明显；与模型组比较，续断种子方组血清睾酮、生精上皮层数均增加(P<0.01)。

表2 续断种子方对血清睾酮、间质细胞、生精上皮层数水平的影响

3.4 睾丸组织病理学

图1示，在正常对照组中可见睾丸的正常组织学特征，如生精上皮层正常厚度，有大量生精细胞和间质细胞(图1A)。相反，模型组小鼠表现出排列松散萎缩的曲细精管，变薄的生精上皮细胞，特别是在减数分裂阶段生精细胞脱落增多和少量的间质细胞减少(图1B))。在维生素E组中，尽管生精上皮变薄，但在生精小管中可见许多成熟的精子细胞(图1C)。在续断种子方组中，生精上皮层变厚，不同阶段的精子细胞排列分布，在曲细精管中可见许多成熟的精子细胞，此外续断种子方治疗组中的间质细胞数增加(图1D)。

3.5 附睾组织病理学

图2示，正常对照组附睾组织的精子浓度正常，早熟精子细胞很少(图2A)。模型组精子浓度降低，附睾尾部的曲细精管中早熟精子细胞的数量增加(图2B)。续断种子方组和维生素E组均能改善精子浓度，降低附睾尾部早产精子细胞数量(图2C)和(图2D)。

注：A.正常对照组；B.模型组；C.维生素E组；D.续断种子方组图中黑色箭头指示早熟精子图2 光镜显微镜下各组小鼠附睾尾组织切片比较(HE染色×400)

3.6 生精细胞凋亡阳性率比较

图3示，特异性免疫组织学染色c-kit阳性信号是细胞质、细胞核内的棕黄色颗粒,染色阴性为未着色细胞或仅可见棕黄色，阳性细胞即为凋亡细胞。在光镜显微镜下(×100)可看到，细胞凋亡大多发生于精母细胞和精原细胞。模型组 (12.54±2.88)%，维生素E组(6.46±2.19)%，续断种子方组(2.71±2.13)%，与模型组比较，续断种子方组凋亡阳性率显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

注：A.正常对照组；B.模型组；C.维生素E组；D.续断种子方组(图中黑色箭头示凋亡细胞)图3 光镜显微镜下各组小鼠睾丸组织切片比较(HE染色 ×100)

4 讨论

少精子症是男性不育症中最常见的类型，其发病机制尚未完全清楚，是目前男性不育研究的热点之一。根据2017年欧洲泌尿外科学会公布的数据显示，男性不育患者中少精子症比例呈上升趋势[12]。我国不孕不育率已高达15%，其中由男方引起的不育约占50%[13]。内分泌激素异常是导致男性不育或生育力低下的主要原因之一[14]。前期临床实践及实验研究均证实，续断种子方可提高精子质量[7-8，15]。本实验进一步探索续断种子方促生精功能障碍模型小鼠精子发生的潜在机制。

环磷酰胺作为烷化剂，是引起生精功能障碍的因子之一。在本研究中，成年雄性小鼠腹膜内注射环磷酰胺5 d后可诱导生精功能障碍，能直接引起大量精原细胞和精母细胞凋亡,干扰生精细胞增殖和分化，从而阻碍生精细胞有丝分裂,导致精子数量生成减少[10]。有研究报道，环磷酰胺可通过增强Bax基因的表达诱导间质细胞大量凋亡,睾酮分泌减少,最终导致生精上皮细胞凋亡[16]，精子数量减少。研究发现，注射环磷酰胺可明显降低小鼠精子浓度及活动，引起睾丸附睾的组织学损伤。在模型组，可见小鼠睾丸组织曲细精管萎缩明显，生精上皮变薄，生精细胞和间质细胞明显减少。相反，续断种子方组经治疗后睾丸相对质量、精子浓度和活动力显著增加，睾丸组织生精上皮层变厚，间质细胞数量增加，分泌高水平睾酮。与模型组比较，续断种子方治疗后可明显增加附睾管中精子浓度和活力，减少附睾管中早熟的精子细胞。研究表明，续断种子方组可明显修复环磷酰胺所致小鼠睾丸组织的损伤，促进精子发生。

睾酮是精子发生的主要调节因子，通过与雄激素受体(AR)结合起作用。睾酮自间质细胞分泌后，可经支持细胞进入生精小管转变为双氢睾酮，与生精细胞的雄激素受体结合促进精子生成。在缺乏睾酮或AR功能失调的情况下，精子发生在减数分裂过程中将会停滞，使少数生殖细胞发育到单倍体精子细胞阶段和细长精子细胞阶段后不能发育为成熟精子[17-19]；另外，附着到圆形精子或方形精子的间质细胞不能维持生殖细胞营养，使精子细胞过早成熟[20]，形成畸形精子、少弱精子；此外，在没有睾酮信号传导的情况下，成熟的精子细胞被支持细胞保留和吞噬[17]，精子减少。模型组小鼠睾酮水平的低下可能是由于睾丸及附睾组织损伤、间质细胞数量分泌减少所致；续断种子方组小鼠间质细胞数量增多，睾酮明显升高，生精细胞凋亡阳性表达明显减少。有研究报道，睾酮水平升高可抑制生精细胞凋亡，促进精子发生，二者有密切关系[21]。因此课题组认为，续断种子方提高模型小鼠精子浓度机制可能与增加间质细胞数量，分泌高水平睾酮，抑制生精细胞凋亡，促进精子发生有关。

中医多从“肾虚”“脾肾两虚”“肝肾同源”论治男性不育症。通过文献研究和临床经验总结，课题组认为“营气不从，肾精亏虚”是男性不育症的主要病因病机，“营气不从”即指睾丸附睾局部气血不足。《黄帝内经》云：“邪之所凑，其气必虚”。睾丸局部气血不足，营卫失和，血管通透作用失调，血郁热聚，经络阻隔，日久肾子失养则不育，治以“健脾益肾，活血生精”的续断种子方。该方源于明·岳甫嘉《医学正印》“补肾健脾益气种子煎方”,岳甫嘉[22]认为此方乃“盖精神气血，皆脾土所化生。此方得种子生息之元，生精最速，阳事易举，若能节欲，生子更易。真方之王道而神奇者”。“续断种子方”由续断、骨碎补、杜仲、牛膝、菟丝子、枸杞子、女贞子、党参、白术和山药组成，方中续断、党参补肾生精、健脾补血；枸杞子、菟丝子、女贞子补肾生精、益气活血；牛膝、红藤、杜仲、骨碎补活血通络、补肾生精；山药、白术健脾益气、生精固精，诸药合用共奏健脾益肾、活血生精通络功效。药理研究表明，枸杞子、菟丝子含有总黄酮类物质，可以提高睾酮激素水平，抑制生精上皮细胞凋亡，同时具有清除自由基、抗氧化损伤作用[23-24]。女贞子含有大量微量元素Zn，可刺激生精细胞增殖，增加间质细胞数量，为精子发生和成熟提供条件[25]。续断、杜仲可降低睾丸组织中的活性氧，减少睾酮的合成和DNA损伤，达到抗自由基损伤功效[26-27]。牛膝能抑制精索静脉血管内皮细胞的增殖，有效预防脂多糖对精子的损伤[28]。

本研究表明，续断种子方促进少精子症模型小鼠精子发生的机制可能为，通过改善睾丸微环境，增加间质细胞数量，分泌高水平睾酮，抑制生精细胞凋亡，从而促进精子发生。但升高的睾酮抑制生精细胞凋亡的机制以及是否通过基因调控来实现，尚有待进一步探讨。