microRNA-125b及其相关因子Bcl-2、 MMP-2在扁平苔藓中的表达

李媛媛， 王君， 杨培， 韩莎莎， 路金明

(青岛大学附属医院，山东 青岛 266003)

扁平苔藓(lichen planus,LP)是一种慢性炎症性皮肤病，其病因及发病机制目前尚未完全明了，主要认为是T细胞介导的自身免疫性疾病，CD8+细胞毒性T细胞诱导的上皮细胞凋亡在疾病中起到关键性作用。越来越多的证据表明，microRNAs(miRNAs)在炎症和自身免疫性疾病的发病机制中发挥着重要作用，是一个有吸引力的治疗靶点。扁平苔藓与细胞凋亡的发病机制相关，B细胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)基因有抑制细胞凋亡的作用，可能在扁平苔藓病变的早期发生作用；Bcl-2基因表达的不平衡将干扰淋巴细胞的程序性死亡，使其寿命延长进而导致扁平苔藓中淋巴细胞凋亡减少[1]。MMP-2是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族的一员， MMPs能够降解细胞外基质(extracelluar matix,ECM)的主要成分，包括胶原、明胶及纤维蛋白等，在炎症反应、血管形成、细胞凋亡中发挥重要作用。近年来研究表明MMPs与扁平苔藓发病密切相关[2-4]。miRNA-125b是miRNA家族中的一员，有研究指出miRNA-125b在口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)中表达降低，并通过双荧光素酶报告基因实验验证MMP-2是miRNA-125b的靶基因[5]。此外， Zhao等[6]通过双荧光素酶报告基因实验验证Bcl-2是miRNA-125b的靶基因。已有研究[7]表明Bcl-2在皮肤扁平苔藓患者中表达率明显高于正常人，然而，miRNA-125b及其下游靶蛋白Bcl-2、MMP-2是否在皮肤扁平苔藓的发病机制中发挥作用尚未见报道。因此，本研究检测miRNA-125b、Bcl-2、MMP-2在扁平苔藓组织及正常组织的表达水平，并进行Spearman相关性分析，旨在探讨miRNA-125b及其靶蛋白Bcl-2、MMP-2在LP发病中的意义。现将结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集我院皮肤科 2018年10月—2020年3月40例经活检确诊为扁平苔藓患者的皮肤组织标本作为病例组，其中男20例, 女20例, 年龄22～64岁, 平均 (43.42±11.44) 岁。纳入标准：根据典型皮损，结合特征性组织病理表现：表皮角化过度，颗粒层楔形增厚，棘层不规则增厚，表皮突呈锯齿状，基底细胞液化变性，真皮上部淋巴细胞呈带状浸润，真皮乳头层可见胶样小体及噬黑素细胞。所有患者均排除其他系统性疾病，均未系统使用糖皮质激素治疗。同期选取美容外科手术切除的正常皮肤组织标本35例作为对照组，其中男18例, 女17例，年龄22～64岁, 平均 (38.97±11.52) 岁。两组间的年龄(t=1.68)、性别(2=0.02)差异无统计学意义(P值均>0.05)。本研究方案经医院伦理委员会审批通过(批件号：QYFYWZLL25771)，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 切取两组活检组织标本，立即在液氮中冷冻30 min，并放在-80 ℃的冰箱保存待用。

1.2.2 RT-PCR检测miRNA-125b的表达 采用Trizol( 日本Takara 公司，批号9108)从皮肤活检样本中分离出总RNA，并参照逆转录试剂盒(日本Takara 公司，批号050919) 操作步骤将定量后的 RNA 逆转录合成 cDNA,反应体系为10 μL(2×mRQ Buffer 5 μL， RNA模板3.75 μL， 1.25 μL Enzyme)。以 cDNA 为模板，将配制好的 20 μL 反应体系(10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix、1 μL cDNA、各 0.4 μL 上下游引物、8.2 μL DEPC水) 按照设定的反应条件(95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、40循环；95 ℃ 5 s、60 ℃ 1 min、95 ℃；50 ℃ 30 s) 在 PCP 仪上进行扩增。采用 2- △△CT法计算目的基因的相对表达水平。其中，miRNA-125b引物(F：5′-CCTGAGACCCTAACTTGTGA-3′),U6引物(F：5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′,R：5′-TGGAACGCTTCACGAAATTGCG-3′)由上海生工公司合成。

1.2.3 ELISA法检测Bcl-2、MMP-2的表达 根据试剂盒(Elabscience Biotechnology公司，批号 E-EL-H0114c) 说明书步骤检测扁平苔藓及正常皮肤组织标本中Bcl-2的含量；根据试剂盒(Elabscience Biotechnology 公司，批号 E-EL-H1445c) 说明书步骤检测扁平苔藓及正常皮肤组织标本中MMP-2的含量，均设置空白对照孔。采用波长450 nm测量每孔吸光度，根据标准曲线的结果计算出各因子的表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Bcl-2、MMP-2表达水平比较

ELISA 法结果显示，与对照组相比，LP 患者组织中Bcl-2、MMP-2的表达水平均明显升高，差异有统计学意义(P值均< 0.05)。详见表1。

表1 两组皮肤组织Bcl-2、MMP-2表达水平比较Tab.1 Comparison of the levels of Bcl-2 and MMP-2 between patients and controls

2.2 miRNA-125b的表达水平比较

RT-PCR检测结果显示，与对照组miRNA-125b 的表达水平(0.93±0.93)相比，LP患者组织中水平(0.54±0.62)明显降低，差异有统计学意义(t=-2.18,P<0.05)。

2.3 miRNA-125b与Bcl-2、MMP-2水平的相关性分析

Spearman相关分析显示，miRNA-125b表达水平与Bcl-2呈负相关(r=-0.26，P=0.027)(图1)，但与MMP-2表达水平无明显相关(r=-0.22,P=0.056)。

图1 miRNA-125b在LP中的组织表达与Bcl-2呈负相关Fig.1 There is a negative correlation between the expression of miRNA-125b and Bcl-2 in LP.

3 讨论

扁平苔藓是一种T细胞介导的炎症性疾病，好发于中年人的四肢，可累及口腔、生殖器黏膜，其病因仍不清楚。miRNA家族在调控基因表达中的重要作用日益受到关注，其调控的基因涉及细胞增殖、凋亡、生长、分化和代谢、血管化和免疫应答等多种生物过程，其表达谱和表达量的变化与多种疾病如肿瘤、炎症性疾病、自身免疫性疾病的发生、发展密切相关。大多数已发表的研究集中在OLP的发病机制，对miRNA在LP发病机制中的作用研究少有报道。miRNA-125b是一种广泛存在的miRNA，研究证明miRNA-125b与细胞凋亡、增殖、迁移和分化等密切相关[8-9]。既往研究[10-11]发现miRNA-125b在LP患者中表达下调， 可能通过增加表皮细胞的增殖、促进细胞凋亡和炎症细胞的聚集在LP病变中发挥作用，此外，miRNA-125b参与一些T细胞介导的炎性皮肤病如银屑病和红斑狼疮的发病机制[12]。本研究发现LP患者皮肤组织中miRNA-125b的表达减少，进一步印证了miRNA-125b的异常表达与LP发病相关。

基底膜(basement membrane,BM)改变是OLP病损的特征性改变,Ⅳ型胶原是基底膜中最主要成分, 其数量减少或功能异常时可影响基底膜的生理功能及细胞功能[13]。只有Ⅳ型胶原酶能降解Ⅳ型胶原, 破坏基底膜的完整性。MMPs中的明胶酶是唯一能够降解ECM和BM中Ⅳ型胶原的酶, MMP-2、MMP-9都属于基质金属蛋白酶中的明胶酶, 其作用底物几乎覆盖了所有基底膜成分, 是研究基底膜损伤最重要的一组酶[14]。MMP-9已被证实在LP 中呈过表达状态，可能与 LP 的发病有关[15]。Wang 等[5]证实脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的OLP 模型中miRNA-125b通过PI3K/Akt/mTOR 途径靶向MMP-2表达，抑制角质形成细胞增殖并促进角化细胞凋亡，结果证实MMP-2表达上调，miRNA-125b表达下调，miRNA-125b的低表达解除对MMP-2的抑制作用，提示miRNA-125b 是 OLP潜在的治疗靶点。一项关于银屑病的研究也证实抑制内源性miRNA-125b可促进角质形成细胞增殖和延迟分化[16]。本研究结果显示miRNA-125b在LP中表达下调，其靶蛋白MMP-2表达上调， miRNA-125b与MMP-2的表达无明显相关性，推测原因可能是实验样本例数较少，需进一步扩大样本量验证。

Bcl-2蛋白是滤泡性淋巴瘤中发现的第一个与易位相关的蛋白,位于线粒体内膜，在核膜和内质网中含量较少，在细胞凋亡保护中起基础作用。角质形成细胞的生长由控制细胞存活的Bcl-2等分子和控制细胞死亡的p53等细胞分子之间的微妙平衡调节。Bcl-2是一种与p53呈负相关的抗凋亡分子，其表达可阻止细胞凋亡，调节线粒体释放细胞色素C。值得一提的是，p53是miRNA-125b的靶蛋白，二者呈负相关，miRNA-125b会降低p53蛋白的表达水平，从而抑制p53诱导的细胞凋亡[11,17]。研究发现[6,18],皮肤LP和OLP患者的Bcl-2蛋白水平升高，类固醇和阿维A治疗后，通过抗增殖和抗炎作用降低了皮肤LP中Bcl-2的表达，治疗后病变的改善表明LP患者中细胞凋亡停止或减少；同时表明Bcl-2没有明显的抗凋亡作用，或在LP的发病机制中有其他重要的机制。Zhao等[6]研究证实miRNA-125b具有明显抑制抗凋亡蛋白Bcl-2转录的能力，双荧光素酶报告基因实验验证Bcl-2是miRNA-125b的靶基因。本研究结果显示，miRNA-125b在LP中下调，其靶蛋白Bcl-2表达上调，二者呈负相关，miRNA-125b通过降低Bcl-2的基因表达，从而抑制细胞增殖和凋亡。

研究显示，与靶向单一蛋白的治疗药物相比，靶向miRNAs(如miRNA-125b)可能是一种改进的癌症患者治疗策略[19]。这给我们提供了一个新的视角，即以调控miRNA的表达来解决人类某些疾病。结合本研究结果，推测调控miRNA-125b的表达可能是抑制Bcl-2的另一种方法，miRNA-125b对Bcl-2的调控可能在皮肤扁平苔藓发病机制中发挥作用，但miRNAs及其靶基因参与LP发病的具体机制，尚需大样本数据进一步明确。