基于PCR指纹技术鹿鞭鉴定方法的建立及检测试剂盒的研制

王雪松，艾金霞*，薛 晗，孙丽媛，王艳双，周亭亭，李明成，张丽华 (.北华大学临床免疫学检验教研室，吉林 吉林 303；.吉林雷宁食品药品检测技术服务有限公司，吉林 吉林 303)

鹿鞭为我国的传统名贵中药材，是鹿科动物梅花鹿(GervusnipponTemminck)和马鹿(CervuselaphusLinnaeus)雄性的外生殖器。鹿鞭又名鹿肾，味甘、咸，性温，自古以来就是临床常用的补肾壮阳、固本培元药物，对于治疗劳损、耳聋、不孕、肾虚、阳痿早泄有显著疗效[1]。由于鹿鞭药效独特、价格偏高，且鹿鞭品种繁多、成分复杂、货源紧俏，各种伪品屡见不鲜，其中牛鞭由于数量较多、价格低廉，常被用于冒充正品鹿鞭出售[2]。因此，急需一种能够快速、准确鉴别鹿鞭的方法，从而确保鹿鞭的临床疗效，为鹿鞭的鉴定和分析提供科学依据。

基于DNA指纹特征对中药材进行的鉴定，弥补了传统鉴定方法的不足，实现了分子水平快速鉴定的目的[3]。《中国药典》(2015年版)中已收录了部分中药材分子的生物学鉴定方法，但由于该方法对实验条件要求高，因此很难在普通药检部门广泛使用。目前多采用性状、纤维和理化[4]等方法，以上传统方法存在主观性强、专属性差等缺点。近年来，DNA条形码[5]、毛细管电泳[6]被应用于动物药材的鉴定，但也都存在不同程度的局限性。国内外尚无同类报道通过鹿鞭DNA检测试剂盒的方法进行鹿鞭及其伪品的快速筛查。本研究通过探讨鹿鞭DNA指纹特征，建立鹿鞭鉴定方法，开发鹿鞭DNA检测试剂盒,从而实现多样品、大规模、短时间、高精准的检测要求，为进一步规范中药材领域的质量标准提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 药材、试剂和主要仪器

正品鹿鞭药材由吉林市龙潭山鹿业有限责任公司提供并鉴定。鹿鞭与牛鞭样品10批次，随机抽取来自吉林、蛟河、四平、长春、延吉等城市，分别为：JLMHLB-1(吉林市梅花鹿鞭1号)；JLMHLB-2(吉林市梅花鹿鞭2号)；SPMHLB-1(四平市梅花鹿鞭1号)；JLMLB-1(吉林市马鹿鞭1号)；JHMLB-1(蛟河市马鹿鞭1号)；JLNB-1(吉林市黄牛鞭1号)；JLNB-2(吉林市黄牛鞭2号)；CHNB-1(长春市黄牛鞭1号)；YJNB-1(延吉市黄牛鞭1号)；YJNB-2(延吉市黄牛鞭2号)。

蛋白酶K、裂解液(含10 mmol/L pH=7.6的Tris-HCl、10 mmol/L Na2EDTA、50 mmol/L NaCl)；2×TaqPCR MasterMix(1000 u)(天根生化科技北京有限公司)；100 bp DNA Ladder(天根生化科技北京有限公司)；引物由上海生工生物工程技术服务公司合成；其他化学试剂均为分析纯。

Gene AmpRPCR System 2700 PCR仪(美国Perkin-Elmer公司)；DYY-7C型水平电泳仪、DYY-8B型稳压稳流水平电泳仪(北京六一仪器厂)；UV WHITE-2020D紫外凝胶成像分析仪(美国Biorad公司)；JD100-3B型电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)；OSE-Y5型第三代变速组织研磨器(北京天根生化科技有限公司)；紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；H2050R台式高速冷冻离心机(美国Becman公司)。

1.2 试剂盒组成

试剂盒由6部分组成，包括DNA提取、PCR扩增，可供20次用量(表1)。

表 1 鹿鞭DNA检测试剂盒组成

1.3 试剂盒法样品总DNA的提取

将鹿鞭与牛鞭样品洗净、剪碎，鲜品于低温下在研钵中研磨或用粉碎机打磨，分别称取各样品50 mg；干品可研磨成粉末状，称取50 mg,备用。将样品置于Eppendorf管中，加入预热的P1溶液500 μL，同时加入P2、P3溶液(30 μL和15 μL)混匀，56 ℃水浴振荡1 h，取出加入P4500 μL，颠倒混匀10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；取上清液加入等体积的P5500 μL，-20 ℃静置1 h，取出4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，弃上清；室温干燥，得沉淀DNA。向沉淀中加入P680μL溶解DNA，-20 ℃保存[7]。

1.4 样品DNA纯度、浓度检测

将模板DNA提取液适当稀释后，用紫外分光光度计测定260 nm和280 nm处的吸光度A260和A280，计算OD260/280的比值即纯度值，并应用相应的稀释倍数计算得出模板DNA的浓度。根据浓度测定结果，将DNA储存液稀释至100 mg/L，-20 ℃保存，为后续PCR扩增备用。

1.5 样品基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测

将DNA稀释液与6×Loading buffer(3∶1)溶液混匀点样于0.8%琼脂糖凝胶板上，电压80 V，时间50 min，将凝胶置于成像分析系统上进行观察、照相。

1.6 引物设计

根据GenBank中梅花鹿鞭(AB 021091.1)、牛鞭(NC 001567)的线粒体细胞色素b基因序列，经过DNA Star 7.0软件比对后，利用Primer Premier 5.0软件设计出鹿鞭特异性引物，然后通过美国国家生物信息中心中的在线软件Primer-BLAST对设计的引物进行评估。最后筛选出一对引物，可特异性扩增出307 bp的目的基因片段。其上游引物为5′-AGACATGAAACATCGGAGTA-3′,下游引物为5′-ATGGGATTCCTGTTGGGT-3′。引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。

1.7 PCR扩增

将DNA稀释液，阳性、阴性对照品各1 μL分别加入到PCR反应管中。PCR循环参数为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，经30个循环之后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.8 样品PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测

取6 μL PCR产物点样于2%琼脂糖凝胶上，调节电压至80 V，电泳50 min。停止电泳，将凝胶置于成像分析系统上进行观察、照相。

1.9 鹿鞭检测试剂盒参数的评价

鹿鞭试剂盒特异性、稳定性、重现性评价。随机挑选一盒试剂盒，对鹿鞭正品及随机抽取来自5个城市10批次市售样品进行特异性检测。将试剂盒由-20 ℃取出，室温下溶解，再置于-20 ℃冷冻，如此反复5次、10次和20次后，进行稳定性验证。并随机抽取3个鹿鞭样品和3个牛鞭样品，在本实验室，由同一实验员在相同条件下采用试剂盒进行3次重复检测，对试剂盒进行参数评价。

2 结 果

2.1 样品DNA纯度及浓度检测分析

用试剂盒提取样品DNA的纯度均在1.80±0.10之间，表明DNA样品基本无蛋白质污染。

2.2 样品DNA琼脂糖凝胶电泳结果

采用试剂盒提取鹿鞭和牛鞭样品中的基因组DNA大约在21 kb左右(图1)。

注：M-Marker；1.阳性对照1；2.阳性对照2；3.JLMHLB-1；4.JLMHLB-2；5.SPMHLB-1；6.JLMLB-1；7.JHMLB-1；8.JLNB-1；9.JLNB-2；10.CHNB-1；11.YJNB-1；12.YJNB-2图 1 鹿鞭、牛鞭样品DNA提取琼脂糖凝胶电泳图谱

2.3 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

经PCR扩增反应后，鹿鞭扩增产物DNA分子片段为307 bp，而牛鞭无扩增条带(图2)。

注：M-Marker；1.JLMHLB-1；2.JLMHLB-2；3.SPMHLB-1；4.JLMLB-1；5.JHMLB-1；6.阳性对照1；7.阳性对照2；8.JLNB-1；9.JLNB-2；10.CHNB-1；11.YJNB-1；12.YJNB-2；13.阴性对照图 2 鹿鞭、牛鞭PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱

2.4 鹿鞭试剂盒检测参数结果

2.4.1特异性

由吉林市龙潭山鹿业有限责任公司提供并鉴定的正品鹿鞭药材，随机抽取来自吉林、长春、四平、蛟河、延吉等城市的鹿鞭与牛鞭样品10批次，采用试剂盒进行检验结果显示，所有鹿鞭正品扩增后在307 bp处出现一条片段。而牛鞭样品经扩增后无条带，试剂盒特异性强(图3)。

注：M-Marker；1.阳性对照1；2.阳性对照2；3.JLMHLB-1；4.JLMHLB-2；5.SPMHLB-1；6.JLMLB-1；7.JHMLB-1；8.JLNB-1；9.JLNB-2；10.CHNB-1；11.YJNB-1；12.YJNB-2;13.阴性对照图 3 鹿鞭、牛鞭PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱

2.4.2稳定性

试剂盒经反复冻融5次、10次和20次后，仍能提取鹿鞭DNA并经扩增后在307 bp处出现一条片段，试剂盒稳定性良好(图4、5、6)。

注：M-Marker；1.阳性对照1；2.JLMHLB-1；3.SPMHLB-1；4.JLMLB-1；5.JLNB-1；6.CHNB-1；7.YJNB-1；8.阴性对照图 4 试剂盒反复冻融5次检测样品PCR产物电泳图谱

注：M-Marker；1.阳性对照1；2.JLMHLB-1；3.SPMHLB-1；4.JLMLB-1；5.JLNB-1；6.CHNB-1；7.YJNB-1；8.阴性对照图 5 试剂盒反复冻融10次检测样品PCR产物电泳图谱

注：M-Marker；1.阳性对照1；2.JLMHLB-1；3.SPMHLB-1；4.JLMLB-1；5.JLNB-1；6.CHNB-1；7.YJNB-1；8.阴性对照图 6 试剂盒反复冻融20次检测样品PCR产物电泳图谱

2.4.3重现性

将试剂盒存放12个月后，对市售鹿鞭和牛鞭样品进行3次重复检测，鹿鞭均出现一条片段且与阳性对照品位置一致，牛鞭样品扩增后仍然无条带，表明试剂盒具有良好的重现性。

3 讨 论

DNA鉴定方法是目前研究的热点[8]，由于DNA指纹技术具有专属性强、技术简便等优点，已被广泛用于物种的鉴定和遗传学研究[9]。《中国药典》(2015年版)已收录DNA指纹鉴定法作为检测中药的国家标准。采用线粒体DNA指纹特征构建鹿鞭DNA指纹图谱，该方法较为前沿[10]，本团队成员建立了蕲蛇、乌梢蛇、川贝母等中药材特异性DNA指纹片段的克隆及鉴定方法[11]，本研究在此基础上开发了鹿鞭DNA检测试剂盒，并进行结果分析。

本研究开发的鹿鞭DNA检测试剂盒分别对新鲜鹿鞭和干品鹿鞭提取线粒体DNA。结果发现，新鲜鹿鞭提取条带完整清晰，泳道背景没有抹迹现象，干品鹿鞭虽经过炮制、风干、存放，其纯度仍在1.80±0.10之间，说明试剂盒提取DNA峰度高、完整、没有降解和污染，为后续PCR扩增提供了良好的基础。

本研究利用自主研发试剂盒，建立了鹿鞭鉴定方法。结果显示：鹿鞭样品在307 bp处出现一条清晰的特异性条带，与阳性对照结果完全一致，而牛鞭样品则无条带，正品与伪品有明显差别，可作为鹿鞭药品鉴定的有效方法。并对试剂盒的特异性、稳定性、重现性进行验证。试剂盒经过反复冻融5次、10次、20次后，其提取和扩增结果完全能够特异性鉴别鹿鞭及其伪品。试剂盒经存放12个月后，对市售鹿鞭和牛鞭样品进行重复检测，结果依然准确可靠。

实验应用自主研发试剂盒，克服了现行质量鉴定方法的局限性。传统鉴别方法有薄层色谱法，其重现性较好，但对于牛鞭这种同源性较高的易混品会产生鉴别困难的情况[12]。红外光谱法其优点是不破坏样品、所提供信息量大，而在图谱分析方面要求有较为丰富经验的实验人员来操作[13]。高效液相色谱法检测灵敏度高，但分析成本以及仪器的日常维护费用较高[14]。而早期分子水平鉴定常常需要联合DNA测序技术，不仅成本高、繁杂费时，同时对实验条件要求也十分严格。本实验利用中药DNA指纹特征所建立的试剂盒检测方法，实现了标准化试剂、标准化操作，可避免不同因素对实验结果造成的影响，提高检测结果的可比性，每批次可检测20个样品，高效、特异、准确、省时、方便。可满足鹿鞭及其伪品的分析鉴定需求，可作为鉴别鞭类制品标准化研究的有效手段，可以广泛地应用到药品检验的各基层单位，具有重要推广价值。