糖肾灌肠方联合替米沙坦对糖尿病肾病小鼠的影响

马 静,郭诗韵,冯程程,卢 军,马 丽*

(1.新疆维吾尔自治区中医医院内分泌科,新疆 乌鲁木齐 830000;2.新疆医科大学,新疆 乌鲁木齐 830000;3.新疆维吾尔自治区中医医院药学部,新疆 乌鲁木齐 830000)

糖尿病肾病是糖尿病进展到后期出现的一种严重并发症,是导致终末期肾病的重要原因[1],可增加高血压发生率和心血管疾病发生风险,并造成严重的社会、经济负担[2-3]。该疾病发生因素是多方面的,不仅包括高糖条件下醛糖还原酶、多元醇代谢、蛋白激酶C 通路的激活等,还与固有免疫与慢性炎症反应[4]有关,其中固有免疫系统TLRs 通过激活NF-κB 信号通路来促进炎性反应[5],激活免疫细胞,分泌炎症介质和细胞因子参与病情发生发展。近年来发现,TLR4 通过固有免疫、炎症、足细胞损伤、肾纤维化等几个关键方面介导糖尿病肾病发展[6],那么同样作为TLRs 家族的Toll 样受体-5 (TLR5) 也有可能是相关靶点。

糖肾灌肠方在新疆维吾尔自治区中医医院内分泌科临床使用近20 年,可应用于糖尿病肾病的各临床分期,具有改善腰膝酸困、乏力、面色晦暗、肢体浮肿、恶心、纳差等症状,对微量蛋白尿期向临床蛋白尿期的进展可明确干预。前期研究表明,该方可降低糖尿病肾病患者血同型半胱氨酸、内皮素水平,明确了其确切作用机制之一[7],而在应用肠道途径延缓病程方面,不仅可降低上述2 种因子水平,还能降低尿蛋白、尿素、肌酐水平,调节血糖、血压,改善临床症状[8]。由于炎症是糖尿病肾病发病的重要机制之一,故本实验考察糖肾灌肠方联合替米沙坦是否可改善炎症,从而影响糖尿病肾病的进展。

1 材料

1.1 动物 SPF 级昆明种小鼠58 只,雌雄各半,6 周龄,体质量(20±2) g,由新疆维吾尔自治区疾控中心实验动物中心提供,动物生产许可证号SCXK (新) 2016-0003。

1.2 药物 糖肾灌肠方组方药材生大黄30 g (产地甘肃,批号170504)、煅牡蛎50 g (产地山东,批号171101)、泽泻30 g (产地四川,批号171003)、丹参15 g (产地山东,批号171005)、槐花30 g (产地河北,批号17060)、黑顺片15 g (产地四川,批号171002)、黄芩30 g (产地甘肃,批号171006) 均由新疆医科大学附属中医院药剂科提供,统一煎煮后由药理室研究人员制成浸膏。替米沙坦片(上海勃林格殷格翰药业有限公司,批号J20150084)。

1.3 试剂 链脲佐菌素(北京索莱宝科技有限公司,批号614J031)；考马斯亮蓝贮备液(南京建成生物工程研究所)；拜安捷2 代血糖测定仪(上海健臻医疗科技有限责任公司)；抗TLR5 兔多抗(武汉Bio-Swamp 公司,批号PAB43755)；抗β-actin 抗体(批号ab8226)、鼠抗兔-HRP抗体(批号ab9484) (英国Abcam 公司)。

2 方法

2.1 模型建立 小鼠适应性饲养1 周后,取10 只作为正常组,喂食基础饲料；其余小鼠均喂食高糖高脂饲料,4 周后,链脲佐菌素分别以60、90 mg/kg 剂量腹腔注射2次。4 d 后,小鼠断尾取血,测定尾静脉血糖值,以≥11.1 mmol/L 为糖尿病建模成功标准,继续喂食高糖高脂饲料6周后收集尿液,测定尿微量白蛋白表达,以＞30 mg/dL 为糖尿病肾病建模成功标准。

2.2 分组与给药 将造模小鼠随机分为模型组、替米沙坦组、糖肾灌肠方+替米沙坦组,正常组、模型组灌胃给予生理盐水,替米沙坦组按0.05 mL/10 g 剂量灌胃给药,糖肾灌肠方+替米沙坦组按0.07 mL/10 g+0.05 mL/10 g 剂量灌胃给药,每天1 次,连续4 周。

2.3 指标检测

2.3.1 一般状态 观察给药后小鼠体质量、行为学变化情况。

2.3.2 肾功能指标 分别收集小鼠尿液和血液,Hitachi7170A 型自动生化分析仪检测血肌酐水平,考马斯亮蓝显色法检测尿微量白蛋白表达。

2.3.3 肾脏病理形态学 小鼠肾皮质用10%中性福尔马林固定,乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,制成3 μm 切片,HE 染色后在光镜下观察。冷刀片切取0.5 mm3小鼠肾组织,置于4%戊二醛固定液中,4 ℃下固定2 h,PBS 清洗3 次,1%四氧化锇固定2 h,乙醇、丙酮梯度脱水,环氧树脂浸透、包埋、聚合、切片,醋酸铀、枸橼酸铅双重染色,在透射电镜(TEM) 下观察。

2.3.4 免疫组织化学 小鼠肾皮质固定,脱水,石蜡包埋,脱蜡,按免疫组化试剂盒说明书操作进行TLR5 (1∶500) 染色,在光镜下观察其分布。

2.3.5 TLR5 蛋白表达 采用Western blot 法。提取小鼠肠道组织总蛋白,液氮研磨,半干法电泳转移至PVDF 膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h,加入一抗(抗TLR5 兔多抗,1∶500稀释)、二抗(鼠抗兔-HRP 抗体,1∶500 稀释),ECL 发光、显影,抗β-actin 抗体(1∶500 稀释) 作为内参,以其与β-actin 比值为TLR5 蛋白相对表达。

2.4 统计学分析 通过SPSS 17.0 软件进行处理,计量资料先进行正态性检验,若符合正态分布,则组间比较采用独立样本t 检验,数据以() 表示；若不符合正态分布,则组间比较采用Wilcoxon 秩和检验。 P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠一般情况 在造模过程中,正常组小鼠毛色光亮,无脱毛,活动自如；模型组小鼠明显瘦小,毛较粗糙,色泽黯淡,食物、水消耗较正常组多,喜静少动。各组小鼠体质量见表1,可知正常组更高(P＜0.05),而其他各组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。另外,给药后模型组、替米沙坦组、糖肾灌肠方+替米沙坦组小鼠分别死亡7、8、6 只,最终纳入37 只进行后续研究。

表1 糖肾灌肠方对小鼠体质量的影响（）

表1 糖肾灌肠方对小鼠体质量的影响（）

注:与模型组比较,△P＜0.05。

3.2 血肌酐水平、尿微量白蛋白表达 与正常组比较,模型组血肌酐水平、尿微量白蛋白表达升高(P＜0.01)；与模型组比较,替米沙坦组、糖肾灌肠方+替米沙坦组两者降低(P＜0.01),其中糖肾灌肠方+替米沙坦组降低程度更明显,但差异无统计学意义(P＞0.05),见表2。

表2 糖肾灌肠方对血肌酐水平、尿微量白蛋白表达的影响（）

表2 糖肾灌肠方对血肌酐水平、尿微量白蛋白表达的影响（）

注:与正常组比较,**P＜0.01；与模型组比较,△△P＜0.01。

3.3 HE 染色 图1 显示,正常组小鼠肾小球毛细血管袢开放良好,肾小球毛细血管壁薄而纤细,血管袢外被足细胞,肾小囊壁完整、纤细；模型组小鼠肾小球体积增大,肾小球细胞增多,毛细血管袢开放尚可,管壁僵硬,足细胞减少,肾小囊壁完整；替米沙坦组小鼠肾小球体积稍大,肾小球细胞增多,毛细血管袢开放尚可,管壁僵硬,足细胞减少,肾小囊壁完整；糖肾灌肠方+替米沙坦组小鼠肾小球体积稍大,肾小球细胞增多,毛细血管袢开放尚可,管壁僵硬,足细胞减少,肾小囊壁完整。

图1 各组小鼠HE 染色（×400）

3.4 TEM 观察 图2 显示,正常组小鼠内皮细胞未见肿胀,系膜细胞未见明显增生,周围系膜基质无扩大,足突细胞未见异常,仅见少量足突融合。基底膜较厚；模型组小鼠系膜细胞核畸形,系膜细胞增生,足细胞核外形不规则,血管腔闭塞,系膜基质不规则,系膜内可见中等电子密度沉积物,基底膜增厚、皱缩,毛细血管皱缩；替米沙坦组小鼠系膜细胞明显增生,系膜基质轻度增生,系膜区可见纤维增生,内皮细胞轻度肿胀,呈连拱状改变,部分空泡样改变,足突可见阶段性融合,肾小球基底膜弥漫性增厚；糖肾灌肠方+替米沙坦组小鼠基底膜轻微皱缩,毛细血管袢塌陷,足突细胞阶段性融合,肾小球基底膜阶段性增厚。

图2 各组小鼠TEM 图（×8 000）

3.5 免疫组织化学 图3 显示,正常组小鼠TLR5 主要分布在肾小球及肾小管中,无明显表达；模型组小鼠TLR 主要表达在近端小管的细胞质内,呈黄色颗粒,在肾小体、远端小管内均无阳性表达；替米沙坦组小鼠TLR5 主要表达在近端小管的细胞质内,呈浅淡黄色颗粒,弱阳性表达,在肾小体和远端小管细胞无阳性颗粒；糖肾灌肠方+替米沙坦组小鼠肾小球、肾小管细胞质中均有少量淡黄色颗粒。

3.6 TLR5 蛋白表达 与正常组比较,模型组、糖肾灌肠方+替米沙坦组TLR5 蛋白表达升高(P＜0.01),替米沙坦组、糖肾灌肠方+替米沙坦组之间差异无统计学意义(P＞0.05)；与模型组比较,正常组、替米沙坦组、糖肾灌肠方+替米沙坦组TLR5 蛋白表达降低(P＜0.01),见表3、图4。

图3 各组小鼠免疫组织化学染色（×400）

表3 糖肾灌肠方对TLR5 蛋白表达的影响（，n=5）

表3 糖肾灌肠方对TLR5 蛋白表达的影响（，n=5）

注:为方便绘制Western blot 图,每组均取5 只小鼠。与正常组比较,**P＜0.01；与模型组比较,△△P＜0.01。

4 讨论

糖尿病肾病为糖尿病主要微血管并发症之一,是慢性高血糖所致的肾脏损害,病变累及全肾,临床上以持续白蛋白尿、肾小球滤过率进行性下降、高血压、水肿、贫血为主要特征,如不积极治疗,则最终进展为终末期肾病[9]。因此,如何延缓糖尿病肾病进展成为目前治疗的重中之重。

本实验结果表明,替米沙坦后可降低糖尿病肾病小鼠尿微量白蛋白表达,而且在此基础上结合糖肾灌肠方灌肠治疗后肌酐、尿微量白蛋白表达也有所下降,虽然差异虽无统计学意义,但扩大样本量后可能会更明显地观察到此趋势,这与患者使用后明显降低尿微量白蛋白的报道相符[10-11]。由此表明,糖肾灌肠方在改善糖尿病肾病进展中发挥了一定作用,而且在光镜、电镜下发现治疗后肾小球基底膜、足突细胞改善,也能印证这一事实。

大量研究表明,炎症、免疫反应在促进糖尿病肾病发生发展中具有重要作用,而Toll 样受体(TLRs) 系统在激活炎性反应信号转导通路、启动和调节天然免疫、诱导获得性免疫中扮演重要角色,其中TLR2、TLR4 均参与了炎症反应[12]。近年来,Toll 样受体-5 (TLR5) 的致炎作用也受到广泛关注,它是机体免疫系统识别细菌鞭毛蛋白的受体,与鞭毛蛋白结合后介导机体针对病原菌的先天性免疫反应及炎症反应,在体内外实验中均可发现肠腔上皮细胞能产生该因子[13-14]。本研究发现,替米沙坦干预后TLR-5蛋白表达明显下降,联用糖肾灌肠方后其表达稍上升,可能是其余蛋白表达所致,但在靶器官肾脏中其改善程度更明显,故推测可能通过抑制其表达来使肠道炎性反应及免疫反应明显改变。

图4 各组小鼠TLR5 蛋白表达

糖肾灌肠方由生大黄(后下)、煅牡蛎、丹参、黑顺片(先煎)、泽泻、生槐花、黄芩等药材组成,方中君药大黄具有攻积导滞、泻火解毒、凉血化瘀、泄浊利尿等功效。佐以质重之牡砺,以敛阴潜阳。收敛固涩,化痰软坚；与丹参、生槐花共同作用以充分吸附肠道毒素,可清除三焦壅塞湿浊之邪,荡涤肠胃热毒之秽,使氮质代谢产物从肠道排出,而且其“泻而不猛”；黑顺片辛温大热,其性善走,为通行十二经纯阳之要药,外则达皮毛而除表寒,里则达下元而温痛冷,制约大黄寒凉之性；泽泻气平,味甘而淡,最善渗泄水道,专能通行小便；黄芩性清肃以除邪,味苦以燥湿,故能清热泻火解毒。研究表明,大黄可显著降低糖尿病肾病大鼠血浆中尿素、肌酐水平,改善肾脏病理组织学病变,对肾脏具有明显的保护作用[15]；黄芩中黄芩苷能降低链脲酶素诱导的糖尿病大鼠的血糖水平[16],而黄芩素对肾病、视网膜病变等糖尿病并发症都有一定治疗作用[17]；煅牡蛎含有大量的碳酸钙,在收敛吸附方面起到一定作用,不但可遏制大黄泻下太过,还能增加灌肠液的渗透压,有利尿素、肌酐等毒性物质的排出。

中药保留灌肠是一种传统的中药透析法,结肠黏膜上皮细胞的面积可达10 m2左右,较腹膜和体表面积大5 倍,加上结肠频繁蠕动,使透析液与结肠黏膜充分接触,加速肠腔与血液间的物质交换,使部分药液在结肠内吸收,而部分直接发挥作用,促使毒素从肠道排出,降低血肌酐、尿素氮水平。尤其是糖尿病肾病肾功能不全的患者,因多年糖尿病导致其胃肠功能均有不同程度的损害,相关症状突出,加之肾功不全毒素蓄积体内,又进一步刺激胃肠引发中毒症状,使得服药困难。中医认为,肺与大肠相表里,药物经肠道吸收后可过经脉上传于肺,由其宣发肃降之性将药物作用送至全身,从而发挥药效。

综上所述,糖肾灌肠方联合替米沙坦对糖尿病肾病小鼠肾损伤具有保护作用,可能与下调TLR5 蛋白表达有关。但中药具有多靶点的特点,故对糖肾灌肠方具体参与机制仍需进行深入研究。