柴胡和白芍醋炙前后组方对四逆散中5 种成分的影响

莫子晴 蔡 皓 *段 煜裴 科刘 静张雅婷钮敏洁

(1.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心,江苏 南京 210023;3.山西中医药大学制药与食品工程学院,山西 太原 030024)

四逆散最早记载于张仲景所著《伤寒论》,由柴胡、白芍、枳实、炙甘草四味药组成,具有疏肝解郁、和解表里之功效,为调节情志作用的经典名方,也是中医临床治疗抑郁的基础方。醋是中药炮制的一种重要辅料,具有引药入经、破血快、散瘀消肿的作用,被广泛应用于疏肝解郁、散瘀止痛药物的炮制。《本草蒙筌》 有“用醋注肝经,且资住痛” 的记载。柴胡与白芍醋炙后,均能增强其疏肝解郁的作用[1-2]。作为君药和臣药,两者炮制后也显著提高了复方抗抑郁作用的效果[1]。然而,炮制后对复方产生功效及成分的具体影响目前仍然缺乏全面的数据证明。

为了揭示炮制对复方增效的科学内涵,实验室前期采用UHPLC-Q-TOF/MS 技术对柴胡和白芍醋炙前后组方的四逆散化学成分进行比较,并结合多元数据分析手段筛选出12 种成分为柴胡和白芍醋炙后组方四逆散增效的潜在物质基础,包括柴胡皂苷B2等重要成分。柴胡皂苷是柴胡发挥抗抑郁作用的主要成分[3-4],而柴胡皂苷D 为药理活性最高的单体之一[5]。芍药苷可以改善利血平致抑郁模型小鼠脑组织5-HT 和NE 的含有量[6],且对皮质酮和谷氨酸诱导的PC12 细胞具有保护作用[7]。甘草苷是炙甘草的重要活性成分,具有抗氧化、抗癌、抗抑郁等作用[8-10]。另有研究表明,橙皮素具有抗氧化、抗炎、保护心血管及抗肿瘤的药效作用,是枳实的主要有效成分[11-13]。本研究采用双波长HPLC 法探究柴胡和白芍醋炙前后组方对经方四逆散中5 种成分含有量的影响,以期从物质基础的角度阐释中药炮制及配伍组方的科学内涵。

1 材料

1.1 仪器 E2695 高效液相色谱仪、Empower 色谱工作站、2998 紫外检测器(美国Waters 公司)；KQ-500E 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BSA224S-CW 天平(万分之一,德国Sartorius 公司)；Quintix35-1CN 天平(十万分之一,德国Sartorius 公司)。

1.2 试剂与药物 柴胡皂苷D(批号C026181218)、柴胡皂苷B2(批号C051181206)、芍药苷(批号S010180416)、甘草苷(批号G009181216)、橙皮素(批号C017181129) 对照品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司(纯度均大于98%)。柴胡(批号20180601)、白芍(批号20180611)、枳实(批号20190129)、炙甘草(批号20180713) 饮片均购自铜陵禾田中药饮片有限公司,经南京中医药大学药学院中药鉴定教研室刘训红教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱(4.4 mm ×250 mm,5 μm)；流动相乙腈(A) -水(B),梯度洗脱(0～10 min,15% A；10～25 min,15%～22%A；25～35 min,22%～40% A；35～50 min,40%～45.1% A；50～70 min,45.1%～51.2% A；70～97 min,51.2%～95%A；97～100 min,5%A)；体积流量1 mL/min；柱温40 ℃；检测波长210 nm(柴胡皂苷D),240 nm (柴胡皂苷B2、芍药苷、甘草苷、橙皮素)；进样量20 μL。色谱图见图1。

2.2 混合对照品溶液制备 精密称取柴胡皂苷D、柴胡皂苷B2、芍药苷、甘草苷、橙皮素对照品适量,置同一5 mL 量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,配制成质量浓度分别为1.334 mg/mL(柴胡皂苷D)、0.828 mg/mL (柴胡皂苷B2)、1.088 mg/mL (芍药苷)、1.206 mg/mL (甘草苷)、1.124 mg/mL (橙皮素) 的溶液,即得,置4 ℃冰箱保存。

2.3 供试品溶液制备 精密称取柴胡、白芍、枳实、炙甘草各0.2 g,加入20 mL 70%甲醇,称定质量,超声(1 200 W,40 kHz) 处理45 min,静置,70%甲醇补足减失质量,摇匀,滤过,滤液经0.22 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液,即得四逆散供试品溶液[14]；精密称取醋柴胡、醋白芍、枳实、炙甘草各0.2 g,同法制得醋炙品组方四逆散供试品溶液。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 专属性试验 取各样品,在“2.1” 项色谱条件下进样,发现芍药苷、甘草苷、橙皮素、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D 的保留时间分别为16.85、20.03、39.83、45.03、58.38 min,其他成分对测定无干扰,见图1。

2.5 重复性试验 精密称取同一批饮片,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液各6 份,在“2.1” 项色谱条件下进样,测得四逆散中柴胡皂苷D、芍药苷、甘草苷、橙皮素含有量RSD 分别为2.75%、2.38%、1.79%、2.93%,醋炙品组方四逆散(含醋柴胡及醋白芍) 中分别为2.74%、2.58%、1.13%、1.54%、2.16%,表明该方法重复性良好。

2.6 精密度试验 分别精密吸取柴胡皂苷D、柴胡皂苷B2、芍药苷、甘草苷、橙皮素的低、中、高质量浓度对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下连续进样3 次,记录峰面积,测得柴胡皂苷D RSD分别为2.99%、2.02%、1.94%,柴胡皂苷B2RSD分别为1.64%、1.55%、2.04%,芍药苷RSD 分别为1.13%、0.22%、0.43%,甘草苷RSD 分别为2.04%、0.36%、0.36%,橙皮素 RSD 分别为2.75%、0.52%、0.31%,表明仪器精密度良好。

2.7 线性关系考察 精密吸取各对照品母液适量,甲醇稀释成6 个质量浓度,进样量20 μL。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积积分值为纵坐标(Y) 进行回归,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.8 加样回收率试验 取已测含有量的同一批饮片组方四逆散 (含0.05 g 柴胡、0.05 g 白芍、0.05 g 炙甘草、0.05 g 枳实) 及同一批饮片醋炙品组方四逆散(含0.05 g 醋柴胡、0.05 g 醋白芍、0.05 g 炙甘草、0.05 g 枳实) 各6 份,精密加入柴胡皂苷D、芍药苷、甘草苷对照品溶液适量,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,计算回收率。结果见表2。

取已测含有量的同一批饮片组方四逆散(含0.2 g 柴胡、0.2 g 白芍、0.2 g 炙甘草、0.2 g 枳实) 及同一批饮片醋炙品组方四逆散(含0.2 g 醋柴胡、0.2 g 醋白芍、0.2 g炙甘草、0.2 g 枳实)各6 份,精密加入柴胡皂苷B2、橙皮素对照品溶液适量,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,计算回收率及RSD。结果见表3。

表2 四逆散中各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents in Sinisan （n=6）

2.9 稳定性试验 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,室温下放置,于0、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样,测得四逆散供试品溶液中柴胡皂苷D、芍药苷、甘草苷、橙皮素的峰面积RSD 分别为2.81%、2.41%、2.38%、1.63%,醋炙品组方四逆散供试品溶液中分别为2.80%、2.41%、1.14%、1.39%、1.00%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.10 样品含有量测定 按“2.3” 项下方法制备6 批供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,计算含有量,结果见表4。

3 讨论

一般而言,在单味药中,柴胡经醋炙后,Ⅰ型皂苷(柴胡皂苷A、柴胡皂苷D) 的含有量会显著下降,而Ⅱ型皂苷(柴胡皂苷B2) 的含有量会明显上升[15-18]。但根据反复实验验证,在柴胡和白芍醋炙后组方的四逆散中,柴胡皂苷D 的含有量不仅没有降低,反而呈现小幅度的升高。柴胡皂苷D 在单味药以及在君药和臣药醋炙前后组方中所表现出的完全不同的变化,进一步表明四逆散中复杂的物质环境能改变同一种物质的溶出和转化。Zhou等[1]研究表明,柴胡皂苷B2是柴胡和白芍醋炙配伍组方四逆散发挥抗抑郁作用的潜在增效物质之一。本实验经多次验证发现,在四逆散中,柴胡皂苷B2的响应值极低,几乎检测不到。而在柴胡和白芍醋炙配伍组方的四逆散中,柴胡皂苷B2的含有量有了明显的升高,表明该推断是合理可信的。

本实验结果表明,柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D的改变是醋炙品组方四逆散增强疗效的重要物质基础。而橙皮素以及甘草苷含有量的改变,进一步表明柴胡和白芍醋炙后与枳实和炙甘草一起组方四逆散,不仅影响自身活性成分的浸出,也对其他中药有效成分的含有量有所影响,这可能是由于柴胡与白芍醋炙后组方的酸性环境改变了物质的转化和溶出的缘故。醋炙增效以及疏肝解郁的具体机制还有待进一步深入研究。

表3 醋炙品组方四逆散中各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents in Sinisan containing vinegar-processed Bupleuri Radix and Paeoniae Radix Alba （n=6）

表4 各成分含有量测定结果（mg/g，，n=6）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg/g，，n=6）

表4 各成分含有量测定结果（mg/g，，n=6）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg/g，，n=6）

注:与四逆散组比较,**P ＜0.01。