UPLC 法同时测定罗布麻叶中7 种成分

陈 帅,王 亮,齐绒绒,陈春雪,姜茹新,钟方丽

(吉林化工学院化学与制药工程学院,吉林 吉林 132022)

罗布麻叶又名泽漆麻、红根草、野茶叶、茶叶花、野麻等,为夹竹桃科植物罗布麻Apocynum venetum L.的干燥叶,主要分布于我国吉林、内蒙古、河北、新疆、河南等地。药用罗布麻叶一般在夏季采收,除去杂质,干燥即得。2020 年版《中国药典》 记载其性味甘、苦,凉,归肝经,具有平肝安神、清热利水之功效,临床上主要用于肝阳眩晕、心悸失眠、浮肿尿少等症[1-2]。明代《救荒本草》 记载泽漆(罗布麻叶) 采嫩叶,蒸过,晒干,做茶吃亦可；《本草纲目》 记载罗布麻叶具有强心利水,主治四肢面目浮肿、利大小肠、明目轻身的功效[2-4]。目前国内已经开发出以罗布麻叶为原料的茶、片剂、胶囊剂、颗粒剂等多种保健产品,主要用于调节血压、等心血管疾病的辅助治疗[5-8]。现代分离分析表明罗布麻叶中含有黄酮类、鞣质、有机酸类、皂苷类、挥发油等多种成分,其中黄酮类和有机酸类为其主要药效成分[9-12]。目前,2020 年版《中国药典》 一部中仅对HPLC 法测定罗布麻叶中金丝桃苷的含有量进行了规定,这显然无法全面反映药材的质量。文献中常见采用HPLC 法测定罗布麻制剂中一种或多种成分的含有量[13-15],徐硕等[16]采用一测多评法结合HPLC 对罗布麻叶中6 种黄酮类成分进行含有量测定。UPLC 法较HPLC 法分析速度更快,灵敏度更高,节约溶剂,本研究采用UPLC 法同时测定罗布麻叶中7 种成分的含有量,以期为进一步完善其质量控制体系提供依据。

1 材料

1.1 仪器 ACQUITY UPLC H-CLASS (配置四元溶剂管理器、样品管理器FTN、PDA 检测器)、Empower 3 软件(美国Waters 公司)；MS105 电子分析天平(十万分之一,瑞士Mettler-Toleduo 公司)；KQ-5200DE 超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；H1850 台式高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；1000Y 高速多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)。

1.2 试剂与药物 罗布麻叶共20 批,均购自长春市、吉林市各大药房,由吉林化工学院钟方丽教授鉴定为正品,具体信息见表1。绿原酸 (批号MUST-18092022,纯度99.10%)、金丝桃苷(批号MUST-1603213,纯度98.36%)、异槲皮苷(批号MUST-18051005,纯度99.74%)、槲皮苷 (批号MUST-16120510,纯度99.19%)、槲皮素 (批号MUST-17101104,纯度99.35%)、山柰酚 (批号MUST-14110508,纯度99.8%) 对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为屈臣氏纯化水。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；流动相乙腈(A) -0.2%甲酸(B),梯度洗脱(0～1 min,5%～9%A；1～1.6 min,9%～10%A；1.6～2 min,10%～13%A；2～5 min,13%～14% A；5～8 min,14% A；8～10 min,14%～30% A；10～11 min,30%～45%A；11～11.5 min,45%～60% A；11.5～12 min,60%～90%A；12～12.5 min,90～5% A)；体积流量0.3 mL/min；柱温38 ℃；检测波长,金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚均为360 nm,绿原酸为326 nm；进样量1 μL。

2.2 对照品溶液制备 分别精密称取绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚对照品适量,加甲醇稀释至刻度线,制备成质量浓度分别为164、390、380、72、800、198、100 μg/mL 的对照品溶液,分别精密吸取上述对照品溶液1 mL,置于同一量瓶中,甲醇稀释至刻度,即得混合对照品贮备液,将贮备液稀释至原质量浓度的1/2.5、1/5、1/6.25、1/10、1/20,即得。

2.3 供试品溶液制备 取药材约1.0 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入50% 甲醇50 mL,称定质量,超声(53 kHz、250 W) 处理30 min,放冷,50% 甲醇补足减失质量,摇匀,12 000 r/min 离心5 min,取上清液,0.22 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.4 专属性实验 取“2.2” “2.3” 项下溶液及空白流动相,在“2.1” 项色谱条件下进样分析,记录色谱图,见图1。由此可知,供试品溶液中各待测成分色谱峰与其他峰的分离度均大于1.5,表明该方法专属性良好。

2.5 线性关系考察 分别吸取“2.2” 项下系列质量浓度混合对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,记录色谱图。以各对照品的质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,得到回归方程,以信噪比(S/N) 为3 时对照品质量浓度为检出限,以S/N 为10 时对照品质量浓度为定量限,结果见表2,表明各成分在各自范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验 取同一混合对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下连续进样6 次,记录色谱图,测得绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚峰面积RSD 分别为1.28%、1.05%、1.33%、0.98%、1.27%、1.64%、1.41%,表明仪器精密度良好。

图1 各成分UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液(批号20180201),室温下放置,在“2.1” 项色谱条件下于0、2、4、6、8、10 h 进样,记录色谱图,测得绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚峰面积RSD 分别为1.05%、1.14%、1.08%、1.54%、1.29%、1.38%、1.35%,表明供试品溶液在10 h 内稳定性良好。

2.8 重复性试验 取同一批药材 (批号20180201) 6 份,每份1.0 g,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项下色谱条件下进样,记录色谱图,测得绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚峰面积RSD 分别为 1.73%、1.66%、1.52%、1.89%、1.67%、1.84%、1.61%,表明该方法重复性良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.9 加样回收率试验 精密称取含有量已测定的药材(批号20180201) 粉末6 份,每份0.5 g,置于具塞锥形瓶中,分别精密加入各对照品溶液适量,按“2.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,记录色谱图,得绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的平均加样回收率分别为98.5%、98.1%、105.0%、98.0%、103.0%、98.7%、95.6%,RSD 分别为1.5%、1.9%、1.1%、1.6%、1.5%、1.9%、2.0%。

2.10 样品含有量测定 按“2.3” 项下方法制备20 批药材供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,记录色谱图,计算各成分的含有量,结果见表3。

从表3 中可以看出,20 批药材中绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的含有量范围分别为4.269～6.694、0.646～1.440、0.630～1.529、0.090～0.363、0.136～0.337、0.076～0.263、0.005～0.072 mg/g,反映出不同批次样品中7 种成分的含有量均存在明显差异,含有量波动最小的为绿原酸(RSD 12.7%),其中产地为河北的S16 样品中最高(6.694 mg/g),而产地为新疆的S2、S4、S5、S7、S8、S17 样品中相对稳定(平均值6.061 mg/g,RSD 3.7%)；含有量波动最大的是山柰酚(RSD 63.5%),其中产地为新疆的S1 样品中最高(0.072 mg/g),且产地为新疆的S2、S4、S5、S7、S9、S19 样品中相对稳定(平均值0.025 5 mg/g,RSD 11.2%)。

利用Unscrambler X 软件对含有量测定结果数据进行处理,采用系统聚类分析方法的组间法,以7 种成分的含有量为变量,各批编号及产地为标注个案,平方Euclidean 距离为度量标准,对20 批样品进行聚类分析,结果见图2。

图2 显示,当分类距离大于3.5 时,20 批样品被明显地分为3 大类(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),其中被划为Ⅰ类 的样品包括S3、S11、S15、S18、S19、S20,S1、S6、S10、S12、S13 被划为Ⅲ类,而其余样品被划分为Ⅱ类。其中,产地为新疆的样品S2、S4、S5、S7、S8、S9、S17 被集中划分为Ⅱ类,表明当地药材所含绿原酸等7 种成分的含有量相对稳定。

表3 各成分含有量测定结果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg/g，n=3）

图2 20 批样品聚类树状图Fig.2 Dendrogram of twenty batches of samples

3 讨论

3.1 测定指标确定 罗布麻叶中含有黄酮和有机酸类化合物,通过检索文献和课题组前期研究工作,发现黄酮类、有机酸类化合物都是罗布麻叶中重要的药效成分[6,8,10,17-19],而目前罗布麻叶药材仅以金丝桃苷作为控制质量的指标[1],无法真实反映药材的内在质量。本研究对罗布麻叶中6 种黄酮类和1 种有机酸类成分进行含有量测定,7 种成分均可以作为罗布麻叶含有量测定的指标成分,从而改善了指标成分单一的缺点,以期为罗布麻叶药材质量控制标准的建立提供参考。

3.2 色谱条件优化 本实验考察了ACQUITY UPLC HSS C18SB 1.8 μm、CORTECS UPLC Shield RP181.8 μm、ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm 色谱柱后发现ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm 色谱柱出峰效果较好；流动相考察了甲醇-水、甲醇-水(含0.1%甲酸)、甲醇-水(含0.2%甲酸)、乙腈-水、乙腈-水(含0.1%甲酸)、乙腈-水(含0.2%甲酸) 6 种流动相系统,发现采用前3 种流动相洗脱时,色谱峰峰型较差,分析时间长,各色谱峰与相邻色谱峰分离度不佳,当换用乙腈-水作为流动相时,各成分色谱峰峰型明显改善,整体分析时间也缩短,各色谱峰与相邻色谱峰分离度也明显改善,在换用乙腈-水(含0.1% 甲酸) 后,除金丝桃苷和异槲皮苷外的色谱峰均与相邻色谱峰达到基线分离,继续加大水相中甲酸的浓度,即采用乙腈-水(含0.2% 甲酸) 时,金丝桃苷和异槲皮苷二者也达到了基线分离,且所有待测组分色谱峰峰型较好,样品分析时间适中。

3.3 结果分析 含有量测定结果显示,不同产地的20 批罗布麻叶饮片中7 种成分的含有量存在显著差异,可能与地区生态环境、采收时间、炮制工艺和储藏条件等有关。此外,聚类分析结果显示20 批样品被聚为三类,其中产地为新疆的10 批样品中有7 批被集中划分为Ⅱ类,表明来源于新疆的样品中7 种成分的含有量相对稳定。

本实验建立UPLC 法同时测定罗布麻叶中7 种成分的含有量,该方法分析速度快、准确可靠、稳定性好,结合聚类分析,可初步判断罗布麻叶药材质量的优劣,以期为罗布麻叶药材质量控制的进一步完善提供依据。