三种药用植物精油的提取及抑菌活性研究*

曲 颖，高 原，邹奇缘，高星宇，王亚旭

（哈尔滨商业大学 药学院 细胞与分子生物学研究所，黑龙江 哈尔滨 150076）

精油是通过蒸馏、萃取、吸附或压榨等方式从芳香植物的花、叶、皮、种子、果实等提取出来的具备芳香气味和挥发性的油状类物质，广泛应用于食品、化妆品以及医药领域[1]。植物精油具有广谱抑菌、杀菌功能，有望成为天然抗菌剂，得到众多科研人员的青睐[2]。本文通过水蒸气蒸馏法提取丁香、降香、连翘3 种精油，并对3 种精油的体外抑菌活性进行了测定，为药用植物精油的应用奠定了基础。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 8739）、金色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus ATCC 6538）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC 6633）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis ATCC13076）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosaATCC14442）、变异链球菌（Streptococcus mutans ATCC 35668）哈尔滨商业大学细胞与分子生物学研究所保存；

连翘、丁香、降香由哈尔滨三棵树药材市场购入。营养肉汤培养基、琼脂粉购自北京奥博星生物技术有限责任公司；其它试剂均为分析纯。

SX-700 型高压灭菌（TOMY）；ELx800 酶标仪（BioTek）；FE38 电导率仪（METTLER TOLEDO）；HALO DB-20 紫外分光光度计（Dynamica）；洁净工作台HD L（北京东联哈尔仪器有限公司）；BP-9082精密恒温培养箱（上海一恒科仪器有限公司）。

1.2 实验内容与方法

1.2.1 植物精油的提取 本实验采用水蒸气蒸馏法对植物精油进行提取。将中药饮片粉碎，过80 目，浸泡2h 后，按料液比1∶20 加入加热蒸馏4h，获得溜出液后加入适量NaCl，使水层与油层分离。将油层分离，并加入少量无水硫酸钠进行干燥，过滤，得到植物精油[3]。

1.2.2 植物精油的抑菌活性测定

1.2.2.1 植物精油抑菌圈的测定 采用滤纸片法对植物精油进行抑菌活性研究。无菌条件下在营养琼脂培养基上涂布100μL 浓度107CFU·mL-1致病菌菌悬液，将浸泡30min 五种植物精油的灭菌滤纸片（直径6mm）摆放于培养基上，阳性对照为氨苄青霉素（0.4mg·mL-1），37℃培养 24h 后，观察记录结果，测量每一个抑菌圈的直径[4]。

1.2.2.2 丁香精油的MIC 及MBC 实验 最小抑菌浓度（MIC）的测定，通过二倍肉汤稀释法，采用96孔板，对丁香精油进行抑菌活性研究，将丁香精油用少量DMSO 溶解后作为母液，营养肉汤进行倍比稀释，得到系列梯度浓度样品，分别加入105CFU·mL-1的致病菌，37℃过夜培养12h，观察菌液生长情况，菌液透明澄清时所对应的药液浓度即为MIC，实验重复3 次。

最小杀菌浓度（MBC）是根据MIC 的测定结果，选取MIC、2MIC 和4MIC 对应样品的菌液，并点植于营养琼脂培养基上，37℃过夜培养12h，观察病原菌生长状况，不生长菌落对应的最低药物浓度即为MBC[5]。

1.2.3 丁香精油的膜渗透性实验 将金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌接种于营养肉汤培养基于37℃120r·min-1过夜培养至 107CFU·mL-1，培养液经12000r·min-1，离心 2min，弃上清，沉淀用 PBS 溶液洗涤、重悬。分别加入不同浓度的丁香精油（0.5MIC、MIC、2MIC），空白对照加入等体积的 PBS，37℃培养24h，选取 1、2、4、8、12h，进行 12000r·min-1, 离心2min，取上清。在260nm 下测量紫外分光光度值[6]。实验重复3 次。

2 结果与讨论

2.1 植物精油抑菌圈的测定

通过水蒸气蒸馏装置提取并获得植物精油。3种植物精油对选取的几种细菌均产生明显的抑菌圈。根据抑菌圈大小推测抑菌能力为丁香精油抑菌能力强于其他精油，不同种类精油的抑菌圈直径见表1。后续实验选取丁香精油完成。

表1 不同种类精油的抑菌圈直径（cm）Tab.1 Diameter of antibacterial circle of different essential oils（cm）

2.2 丁香精油的MIC 及MBC 实验

进一步选取丁香精油对5 种常见致病菌进行MIC 和MBC 值的测定，其中丁香精油对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的MIC 值分别为7 和14μL·mL-1，见表2。综合抑菌圈直径、MIC 值、MBC 值发现丁香精油对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有较好的抑菌效果。

表 2 丁香精油对 5 种细菌的 MIC、MBC 值（μL·mL-1）Tab.2 MIC and MBC values of clove essential oil against five bacteria（μL·mL-1）

2.3 丁香精油对金黄色葡萄球菌和铜绿假担孢菌的膜渗透性影响

通过丁香精油作用金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌培养物后，检测12h 内260nm 处菌体上清OD值，如图 1a、b 所示。在 0.5MIC、MIC、2MIC 浓度丁香精油作用下，菌体内的DNA 随着时间的推移，向细胞外出现一定的泄露。其中金黄色葡萄球菌在0～8h内，上清DNA 浓度增加较为明显，且高浓度丁香精油在12h 内有明显作用优势。铜绿假单孢菌在0～4h内上清DNA 浓度变化缓慢，4～8h 出现明显上升。推测植物精油可破坏微生物的细胞膜和细胞壁，引起细胞膜通透性改变[7]。

图1 丁香精油对菌株膜渗透性的影响Fig.1 Effect of clove essential oil on membrane permeability of bacterial strain

3 结论

本实验通过水蒸气蒸馏法从药用植物连翘、丁香、降香中提取了连翘精油，丁香精油以及降香精油，并比较了3 种植物精油对大肠杆菌、绿脓杆菌、变异链球菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性。实验结果表明，3 种药用植物精油均有一定抗菌效果，且抑菌活性为：丁香精油>连翘精油>降香精油。进一步对丁香精油进行膜渗透性实验，结果表明，丁香精油能够改变细胞膜渗透性，并进一步导致细菌死亡。本文为药用植物精油的开发及应用提供了理论依据。