阳离子化透明质酸衍生物的护发功效研究

王丽丽，祝美华，薛 松，齐 宁，牛贵清，陈建英,

（1. 山东省药学科学院，山东 济南 250101；2. 山东安华生物医药股份有限公司，山东 滨州 256600；3. 山东省皮肤与黏膜给药工程技术研究中心，山东 济南 250101）

透明质酸（hyalouronic acid，HA）是D-葡糖醛酸（GlcA）和N-乙酰氨基葡糖 （GlcNAc）双糖单位通过交替的β-1, 3和β-1, 4糖苷键连接而成的大分子糖胺聚糖，大量存在于生物体内的多种组织（例如皮下组织、眼球、关节）中，商品透明质酸多为钠盐。它能携带自身500倍以上的水分，具有良好的吸湿性，是目前公认的最佳天然保湿因子，被广泛应用于化妆品等领域[1-3]。HA为聚阴离子多糖，在使用于带负电荷的毛发、皮肤的角质表面时，由于电荷排斥作用，阻碍其在毛发、皮肤表面的吸附。

本研究采用化学方法将季铵阳离子乳酸盐基团引入透明质酸分子中，制备阳离子化透明质酸衍生物，并评价了其保湿、吸附性能，及对损伤毛发的修复效果和对头发柔顺度的改善，为其在化妆品领域中的应用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Unity Inova 400核磁共振波谱仪（美国Varian）；C-MAG HS10型加热磁力搅拌器（艾卡广州仪器设备有限公司）；ZKXFB-2型真空干燥箱（上海树立仪器仪表有限公司）；SHB-B95型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；Agilent 8454型紫外分光光度计（美国安捷伦公司）；AE200型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；JJ-1增力电动搅拌器（江办金坛医疗仪器厂）；320型pH计（瑞士Mettler Toledo公司）；Supra55电子扫描电镜（德国 Zeiss公司）；Unity Inova 400核磁共振波谱仪（美国瓦里安公司）；XJ801型头发梳理仪（上海湘杰仪器仪表科技有限公司）。

1.2 材料

HA（山东安华生物医药股份有限公司，化妆品级）； 2, 3-环氧丙基三甲基氯化铵（GAT，河北百灵威超精细材料有限公司，纯度95 %）；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 阳离子化透明质酸衍生物（HA-GAT-LA）的制备[4]

取HA 10 g和GAT 10 g，混合，加入1 %（g/ml）氢氧化钠水醇（4:1）混合溶液100 ml，于40±2 ℃保温搅拌反应2 h，加入1 %乳酸钠溶液400 ml，溶解并稀释反应产物，过滤，收集滤液，加入95 %乙醇500 ml洗涤沉淀2次，去除上清，过滤收集沉淀，再加入95 %乙醇洗涤沉淀2次，40 ℃减压干燥6 h，得白色颗粒状粉末。

按上述方法，反应结束以10 %氯化钠溶液代替10 %（g/ml）的乳酸-乳酸钠溶液，制备未引入乳酸基团的阳离子化透明质酸钠（HA-GAT）。

2.2 HA-GAT-LA季铵阳离子取代度和乳酸结合率的测定

以D2O为溶剂，采用Unity Inova 400核磁共振波谱仪对HA-GAT-LA进行1H-NMR检测，谱图分析时化学位移以TMS峰位置为标准，以透明质酸、季铵和乳酸基团甲基氢的比例，计算季铵阳离子取代度和乳酸结合率。

2.3 吸湿性和保湿性的测定

精密称取HA、HA-GAT和HA-GAT-LA 各10 g，分别均匀平铺于玻璃平皿中，厚度约2 mm，置92.5 %相对湿度（RH）环境48 h后，再分别置不同湿度环境（硅胶干燥器、43 %RH和81 %RH），于24，48 h取样，测定样品的干燥失重[5-6]，计算样品的水分含量。

2.4 吸附量的测定

选取健康青少年未经烫染的黑色头发，用1 %月桂基硫酸三乙醇胺水溶液浸渍1 min，然后用水清洗，再用吸水纸吸去水分，置硅胶干燥器干燥24 h。加入漂白液（5 %过氧化氢水和 2.5 %氨水按1:1混合），于30 ℃浸渍20 min，反复清洗和漂白10次，制成损伤毛发[7]。

分别取HA、HA-GAT-LA和HA-GAT 0.1 g，置入100 ml量瓶，加水溶解并稀释至刻度，再称取上述溶液4 g，置入50 ml量瓶，加水稀释至刻度，获得浓度约0.008 %的供试品溶液，取20 ml移至带盖试管中，置于 37 ℃水浴。精密称量健康头发和损伤头发各2 g，置于供试品溶液中浸渍10 min。以咔唑显色法[8]测定供试品溶液和浸渍毛发后供试品溶液糖醛酸含量，按下式计算毛发对HA、HA-GAT-LA和HA-GAT的吸附量（R）。

式中A0，A1分别为供试品溶液和浸渍毛发后供试品溶液经咔唑法显色后在530 nm处的吸收度值。

2.5 扫描电镜观察

将2.3项下经HA、HA-GAT和HA-GAT-LA 3种供试液浸渍后的损伤毛发用吸水纸吸干水分，置平皿中于60±5 ℃烘干，和未经浸渍的毛发一起黏贴于样品托上，喷金，置扫描电镜下观察。

2.6 头发梳理试验

取健康长头发一束，分别用普通市售洗发水（对照组）和加入0.5 %HA-GAT-LA的洗发水（试验组）揉洗1 min，大量清水冲洗至无泡沫，吸水纸吸干头发表面水分，置头发梳理仪测定湿梳摩擦阻力，用吹风机将头发吹干之后，测定干梳摩擦阻力。

3 结果

3.1 HA-GAT-LA的阳离子取代度及乳酸结合率

HA-GAT收率＞80 %。1H NMR（400 MHz，D2O）δ：2.03（s，3H）；3.23（s，9H）。以透明质酸和季铵基团甲基氢的比例，计算HA-GAT的季铵阳离子取代度为0.76。

HA-GAT-LA收率＞85 %。1H NMR（400 MHz，D2O）δ：1.32～1.33（d，3H）；2.03（s，3H）；3.23（s，9H）。以透明质酸、季铵和乳酸基团甲基氢的比例，计算HA-GAT-LA的季铵阳离子取代度为0.76，乳酸结合率为85 %。

图1 HA、HA-GAT和HA-GAT-LA的吸湿性

3.2 吸湿性和保湿性

结果见图1。HA、HA-GAT和HA-GAT-LA在92.5 %RH高湿度环境放置48 h后，HA-GAT-LA水分含量远远大于HA和HA-GAT，说明在高湿环境中HA-GAT-LA能迅速吸收大量水分；充分吸湿后的样品再分别置于有硅胶干燥剂的干燥环境中、43 %RH和81 %RH的中等湿度环境中，HA-GATLA和HA-GAT的水分均高于HA，而HA-GAT-LA表现尤其突出，在RH降低的情况下仍能保持较高含水量。以上结果表明，HA-GAT-LA的吸湿和保湿性能明显好于HA和HA-GAT。

3.3 吸附量

结果见图2。HA、HA-GAT和HA-GAT-LA浸渍损伤毛发和健康毛发后，在两种毛发上的吸附量由高至低依次为HA-GAT-LA＞HA-GAT＞HA。结果表明，在透明质酸季铵盐中引入乳酸基团可进一步提高透明质酸在毛发上的附着，HA-GAT-LA具有更好的吸附性能，效果优于HA和HA-GAT。

图2 HA、HA-GAT和HA-GAT-LA在毛发上的吸附量

3.4 扫描电镜观察

结果见图3。电镜图片显示，健康毛毛鳞片规则整齐，贴附于毛杆，毛发表面光滑、突起较少。损伤毛毛鳞片变形，毛发表面粗糙、突起较多。经供试液浸渍之后，毛发均有不同程度的修复，毛鳞片更加贴服，其中HA-GAT-LA浸渍的损伤毛发表面光滑程度接近健康毛发，修复效果明显好于HA和HA-GAT。

图3 HA、HA-GAT和HA-GAT-LA浸渍毛发的扫描电镜图片

3.5 头发梳理试验

干梳摩擦阻力曲线和湿梳摩擦阻力分别见图4、图5，最大阻力见表1。结果显示，用加入HA-GATLA的洗发水清洗头发之后，湿发和干发的摩擦阻力均明显减小，表明HA-GAT-LA可显著改善头发的柔顺度。

图4 健康头发干梳摩擦阻力曲线

图5 健康头发湿梳摩擦阻力曲线

表1 健康头发湿梳和干梳的最大摩擦阻力

4 讨论

由于HA具有良好润滑、保湿和生物相容性，被广泛地应用于生物医药和化妆品领域。为了适应市场诉求的变化，研究者对HA分子进行改性，研制出多种类型的产品，以达到消费者、配方工程师对化妆品不同效果的需求。日本丘比公司通过化学修饰的方法将季铵阳离子基团引入HA，获得的阳离子化HA（即HA-GAT）可用于皮肤和毛发的保湿和修复[7]。本研究通过化学修饰的方法将季铵阳离子乳酸盐基团引入HA，制备得到阳离子化透明质酸衍生物HA-GAT-LA，季铵阳离子的引入改变了HA大分子表面的电荷，乳酸基团的引入进一步提高了HA的保湿和附着功能，效果优于未引入乳酸基团的HA-GAT，HA-GAT-LA能更好地吸附于毛发、皮肤的角质表面，发挥高吸湿、保湿和修复效果，有效提高毛发的柔顺度，使毛发更容易梳理，保护其避免损伤，有望开发为新一代的日用化妆品原料。