HPLC同时测定杜仲平压胶囊中4种成分的含量

兰 莹，薛 莹，秦忠雪

（四川省疾病预防控制中心，四川 成都 610041）

杜仲平压胶囊是杜仲叶经提取、加工制成的胶囊剂，由收载于中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第11册中的杜仲平压片改变剂型而得，有补肝肾、强筋骨、降血压功效[1-3]。现代药理研究表明杜仲叶的主要化学成分木脂素类（如桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷）具有调节血压血脂、抑制肿瘤细胞等作用；苯丙素类（如绿原酸）具有抗菌消炎、抗病毒、提高免疫力作用[4-6]。质量控制是保证中药临床有效性及安全性的重要手段，目前，有关杜仲平压胶囊的质量控制研究主要为采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定组方中一个或两个有效成分[10-13]；在《中国药典》2015年版一部中，仅以松脂醇二葡萄糖苷作为杜仲叶定量分析的指标成分[14]。但中药成分构成是一个复杂体系，仅测定单一有效成分并不能全面反映中药整体质量。因此，为有效控制药品质量，本研究采用HPLC对杜仲平压胶囊中桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷4种成分含量同时进行测定，以冀为杜仲平压胶囊质量控制提供参考。

1 材料与仪器

1.1 仪器

美国Waters ACQUITY HPLCTM高效液相色谱仪（包括Empower 3.0色谱工作站，四元高压泵系统，在线脱气系统，自动进样器，柱温箱和TUV检测器，数据采集系统）；XS215分析天平（美国Mettler Toledo公司）；XP6微量天平（美国Mettler Toledo公司）；KQ2576E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；KW8672J型离心机（北京京立离心机有限公司）。

1.2 材料

杜仲平压胶囊（批号：20190908，20190913，20190918，济宁明阳生物科技有限公司）；桃叶珊瑚苷对照品（批号：110712-201614），松脂醇二葡萄糖苷对照品（批号：AN965J01，纯度99.6 %），松脂醇单葡萄糖苷对照品（批号：20181125，纯度99.7 %，中国食品药品检定研究院）；绿原酸对照品（批号：G063981，纯度98.8 %，成都曼斯特生物科技有限公司）；HPLC用甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；娃哈哈纯净水（批号：20181009，郑州市哇哈哈纯净水公司）；甲醇（分析纯，天津市康科德科技有限公司）；磷酸（分析纯，天津市光复精细化工研究所）。

2 方法与结果

2.1 HPLC色谱条件

色谱柱：Diamonsil®Plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.05 %磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，7 %A～18 % A；8～16 min，18 %A～29 % A；16～26 min，29 %A～42 % A；26～38 min，42 %A～60 % A；38～42 min，60 %A～100 % A；42～46 min，100 %A～7 % A；46～55 min，7 % A）；检测波长：330 nm；流速：1 ml/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μl。程序变化波长：10～15 min：210 nm（检测桃叶珊瑚苷），16～20 min：320 nm（检测绿原酸），30～35 min：230 nm（检测松脂醇二葡萄糖苷），35～40 min：230 nm（检测松脂醇单葡萄糖苷）。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷对照品各适量，分别置入10 ml量瓶，用70 %甲醇溶解并定容至刻度，分别得质量浓度为1.2350，3.1250，0.6723，0.5231 mg/ml的对照品储备液。精密移取绿原酸对照品储备液l ml于10 ml量瓶，70 %甲醇定容至刻度，得0.3125 mg/ml绿原酸对照品溶液，之后精密移取其他各对照品储备液1 ml及绿原酸对照品溶液1 ml于10 ml量瓶，70 %甲醇定容至刻度，摇匀，即得桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷质量浓度分别为0.1235，0.06723，0.05231，0.03125 mg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取本品内容物约0.2 g，精密称定，置入10 ml量瓶，加70 %甲醇适量，密塞，称量，超声处理30 min（功率250W，频率33 kHz），冷至室温，再称定重量，用70 %甲醇补足减失重量，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试样品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液制备 取除去杜仲叶外的其他辅料，按2.2.2项下供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，按2.1项下色谱条件进行色谱分析，结果供试品溶液色谱图中，与对照品对应峰的保留时间处有吸收峰，而阴性样品在对照品对应峰的保留时间处未显吸收峰，表明供试品中其他物质对待

图1 专属性考察色谱图

2.3.2 精密度考察 按2.2.2项下方法制备杜仲平压胶囊（批号：20190913）供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行检测，连续进样6针，结果杜仲平压胶囊中桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷峰面积的相对标准偏差（RSD）值分别为0.36 %，0.19 %，0.09 %，0.23 %，表明仪器精密度良好。

2.3.3 线性与范围 精密稀释2.2.1项下混合对照品储备液，各成分浓度如下：桃叶珊瑚苷浓度分别为0.0123，0.0371，0.1235，0.2470，0.3705，1.2355 mg/ml；绿原酸浓度分别为0.0312，0.0625，0.3125，0.0625，0.9375，3.1250 mg/ml；松脂醇二葡萄糖苷浓度分别为0.0067，0.0134，0.0202，0.0672，0.1345，0.6723 mg/ml；松脂醇单葡萄糖苷浓度分别为0.0052，0.0105，0.0156，0.0523、0.1046，0.5231 mg/ml进样检测，以各成分的浓度（x）对其峰面积（y）进行线性回归，得回归方程，见表2。

2.3.4 稳定性考察 按2.2.2项下方法制备本品（批号：20190913）供试品溶液，且分别于制备后0，1，2，4，8，12，24 h，按2.1项下色谱条件进行检测，测定峰面积。结果杜仲平压胶囊中桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷峰面积的RSD值分别为1.31 %，0.36 %，1.65 %，2.02 %，1.08 %，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性考察 取本品（批号：20190913）内容物，按2.2.2项下方法制备供试品溶液6份，进样检测，以峰面积计算各成分含量。结果得6份供试品溶液中桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷的平均含量分别为1.0601，5.7701，0.6853，0.3816 mg/g，RSD分别为0.87 %，1.06 %，1.35 %，2.28 %，说明重复性良好。

表2 线性关系

2.3.6 加样回收率考察 取本品（批号：20190913）内容物约0.1 g，精密称定，共9份，分别置入10 ml量瓶，分为3组，以2.3.5项下所测桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷平均含量作为加入对照品量的依据，分别加入约供试品中待测成分质量分数80 %，100 %，120 %的对照品溶液各3份，其中加入桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷对照品溶液浓度分别为0.1235，0.6250，0.1347，0.0523 mg/ml。按2.2.2项下方法制备供试品溶液，以峰面积计算4种待测成分的含量和加样回收率，结果见表3～表6。

2.3.7 样品测定 取3批本品内容物，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项色谱条件测定供试品溶液中桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷的含量。3批样品（批号：20190908，20190913，20190918）的桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷含量分别为1.0809，5.7982，0.6861，0.3821 mg/g；1.0794，5.7977，0.6848，0.38275 mg/g；1.0816，5.7989，0.6849，0.3835 mg/g。

3 讨论

3.1 提取溶剂和方法考察

本实验对提取溶剂甲醇、50 %甲醇、70 %甲醇进行考察，结果以70 %甲醇为提取溶剂样品各待测成分含量较大，因此选择70 %甲醇为提取溶剂。对超声及回流提取方法进行考察，结果2种方法提取率相差不大，但超声操作较为简便，因此选择超声提取方法。

3.2 超声时间考察

对超声提取10，15，20，30，40，60 min进行考察，结果30 min后各待测成分含量趋于平稳，因此选择超声时间为30 min。

3.3 流动相选择

本研究分别对甲醇-水、0.1 %乙腈-水、甲醇-0.05 %磷酸水和乙腈-0.05 %磷酸水4个系统流动相进行考察，结果发现，采用甲醇-0.05 %磷酸水作为流动相时，各峰的分离度较好，且基线平稳，因此采用甲醇-0.05 %磷酸水系统作为流动相。

表3 桃叶珊瑚苷加样回收率试验结果

表4 绿原酸加样回收率试验结果

表5 松脂醇二葡萄糖苷加样回收率试验结果

表6 松脂醇单葡萄糖苷加样回收率试验结果

3.4 检测波长选择

对4种成分标准品溶液分别进行UV全波长（190～400 nm）扫描，发现桃叶珊瑚苷在210 nm、绿原酸在320 nm、松脂醇二葡萄糖苷及松脂醇单葡萄糖苷在230 nm处均有最大吸收，基于杜仲平压胶囊中各成分的最大吸收波长不同，为保证各成分在最大吸收波长处检测，提高灵敏度，减少干扰，本实验采用了HPLC-DAD波长切换技术测定杜仲平压胶囊中4种成分的含量。

综上所述，本试验采用HPLC建立同时测定杜仲平压胶囊中桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷多组分含量的方法，所建立方法重复性好，可操作性强，且方法学考察结果显示，专属性、精密度、线性范围、稳定性、加样回收率均符合要求，能准确测定杜仲平压胶囊中桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单葡萄糖苷多组分含量，提高分析效率，为杜仲平压胶囊质量控制提供一定参考。