HPLC同时测定炎可宁片中9种成分的含量

许学丽 ，宋 迪，王洪明，聂 磊

（1. 山东大学 药学院，山东 济南 250012；2. 滨州市食品药品检验检测中心，山东 滨州 256600；3. 滨州市人民医院，山东 滨州 256600）

炎可宁片为《卫生部药品标准》中药成方制剂第七册收载品种，是一种临床常用药，由黄柏、大黄、黄芩、板蓝根、黄连5味中药组成，具有清热泻火，消炎止痢的功效[1]。目前不同厂家有多个质量标准，但只有部分标准规定有含量测定项，且只对其中的黄芩苷或盐酸小檗碱有规定，不能有效控制产品质量[2-3]。笔者参考相关文献[4-10]，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC），对炎可宁片中的9种有效成分盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚进行含量测定，为更好控制炎可宁片的质量提供了参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AT型HPLC仪，包括紫外检测器、自动进样器、四元梯度泵等（日本Shimadzu公司）；KQ-300VDV 型超声波清洗器（昆山超声仪器公司）；BSG-12电热恒温水浴锅（上海一恒）；CP225D电子分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试剂试药

炎可宁片（修正药业，批号：170608，180404，180507，规格：0.3 g/片）；盐酸小檗碱（批号：110713-201613，含量：86.8 %），黄芩苷（批号：110715-201619，含量：93.5 %），黄芩素（批号： 111595-201808，含量：97.9 %），芦荟大黄素（批号：110795-201710，含量：98.3 %）、汉黄芩素（批号：111514-201605，含量：100.0 %），大黄酸（批号：110757-201607，含量：99.3 %），大黄素（批号：110756-201512，含量：98.7 %），大黄酚（批号：110796-201520，含量：99.2 %），大黄素甲醚（批号：110758-201415，含量：99.1 %）对照品均购于中国食品药品检定研究院；甲醇，乙腈，磷酸等试剂均为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相：甲醇（A）-乙腈-（B）-0.2 %磷酸溶液（C），梯度洗脱（洗脱程序见表 1）；流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 μl。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品各适量，加甲醇溶解并制成上述成分质量浓度分别为41.9，81.6，24.7，2.53，4.98，1.13，2.51，6.79，2.97 μg/ml混合对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液 取本品 20片，除去糖衣，精密称定，研细，取约0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，称定重量，超声处理30 min（功率300 W，频率45 kHz），取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 按炎可宁片的处方比例，制备缺黄柏、大黄、黄芩和黄连的阴性样品，并按2.2.2项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按2.1项下的色谱条件分别进样，进样量5 μl，并记录色谱图，见图1。结果表明，在该色谱条件下，炎可宁片中的9个成分与其他色谱峰能达到基线分离，分离度均大于1.5，理论板数均大于10 000，且阴性样品对9个成分的测定无干扰。

2.4 线性关系考察

取2.2.1项下的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，分别进样1，2，5，8，10 μl，并记录峰面积。以9个成分的进样量（x，ng）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程与线性范围，见表2。炎可宁片中的9个成分在进样量范围内，r值均不小于0.9997，具有良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取2.2.2项下供试品溶液（批号：170608）适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.52 %，0.45 %，0.79 %，0.60 %，0.92 %，1.07 %，0.36 %，0.68 %，0.40 %（n=6），表明精密度良好。

图 1 HPLC色谱图

表2 回归方程与线性范围

2.6 稳定性试验

取2.2.2项下供试品溶液（批号：170608），分别于室温下放置0，3，6，9，12，24 h，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.82 %，0.48 %，0.95 %，0.72 %，0.64 %，1.16 %，1.03 %，0.96 %，0.77 %（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密称取同一批样品（批号：170608）粉末适量，共6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各待测成分含量。结果，盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为6.302，13.239，4.425，0.541，0.836，0.144，0.356，1.180，0.392 mg/g，RSD值分别为 0.63 %，0.36 %，0.55 %，1.02 %，0.90 %，1.28 %，0.75 %，0.84 %，0.50 %（n=6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的样品（批号：170608）粉末约0.3 g，共6份，分别加入混合对照品溶液（盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、汉黄芩素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的质量浓度分别为1.911，4.025，1.350，0.1652，0.2550，0.04416，0.1088，0.3580，0.1202 mg/ml）1 ml，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.9 样品含量测定

取3批样品各适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各待测成分含量，结果见表4。

0.3620 0.3580 0.7146 98.49 0.3546 0.3580 0.7130 100.11 0.3594 0.3580 0.7158 99.55 0.3643 0.3580 0.7189 99.05大黄素甲醚 0.1186 0.1202 0.2347 96.59 98.28 0.98 0.1180 0.1202 0.2360 98.17 0.1203 0.1202 0.2396 99.25 0.1178 0.1202 0.2365 98.75 0.1194 0.1202 0.2371 97.92 0.1210 0.1202 0.2400 99.00

表4 样品含量测定结果/mg·g-1（n＝3）

3 讨论

实验中曾考虑采用多波长来测定炎可宁片中的9个有效成分，但经使用二极管阵列检测器（DAD）分别对供试品溶液和混合对照品溶液中的待测成分进行扫描后发现，在254 nm波长处，9个待测成分均有较好吸收，且与其他色谱峰分离度较好，峰纯度检查结果也均能符合含量测定要求，阴性样品对测定不存在干扰。因此最终选用单波长254 nm作为检测波长，对HPLC仪的要求更低，且操作更简单。

曾采用多个流动相进行预实验，包括乙腈-0.1 %磷酸溶液，甲醇-0.1 %磷酸溶液等[2-7]，并对流动相的比例进行多次调整，进行梯度洗脱，结果炎可宁片中的9个待测成分峰与其他色谱峰的分离度不能达到要求。参考有关文献[8]，最终流动相确定为甲醇-乙腈-0.2 %磷酸溶液，并对流动相的比例进行调整，梯度洗脱，结果9个待测成分峰与其他色谱峰的分离度均符合要求，且峰形均较好，理论板数均大于10 000。

炎可宁片供试品溶液的制备，分别采用超声提取法和回流提取法试验。结果表明，取炎可宁片粉末，用甲醇作为溶剂，超声提取30 min能做到提取完全，与加热回流提取1 h的含量结果相当。超声提取操作更为方便简单，因此最终采用甲醇为溶剂超声提取的方法。

本实验建立了同时测定炎可宁片中9个成分含量的方法，分离度、重复性好，准确度高，专属性强，可为炎可宁片的质量控制和标准提高提供参考。