HPLC双波长法测定米力农注射液有关物质

窦艳丽，牛 冲，康亚琪，文松松，陈 真，李 琳，徐玉文*

（1. 山东省食品药品检验研究院 仿制药研究与评价重点实验室 山东省仿制药一致性评价工程技术研究中心，山东 济南 250101；2. 山东大学第二医院药品调剂科，山东 济南 250033）

米力农（milrinone）为氨力农的同类药物，作用机制与氨力农相同，属于新型正性肌力药物，是治疗心衰的有效药物，主要能强化心肌收缩能力，增加心排量，减轻心脏负荷，降低肺血管阻力，降低肺动脉压，改善心脏功能。近年研究结果表明，米力农对老年慢性心脏病伴心力衰竭、高血压心脏病伴心力衰竭、充血性心力衰竭均有较好的疗效[1-5]。

米力农注射液是由米力农加乳酸制成的灭菌水溶液。米力农注射液的质量标准收载于《中国药典》2015年版（ChP2015）二部与美国药典42版（USP 42），欧洲药典10.0版（EP10.0）未收载此品种。国内上市的该注射液采用葡萄糖或氯化钠作渗透压调节，鉴于采用葡萄糖调节渗透压的产品在执行ChP2015二部标准时出现有关物质检查结果不合格的现象，本文在ChP2015二部米力农注射液质量标准的基础上采用双波长高效液相色谱法（HPLC）检查有关物质[6-8]，方法灵敏度高、操作简便，适用于采用不同渗透压调节剂的产品。

1 仪器、试药及样品

Waters 2695 2489高效液相色谱仪（紫外检测器，四元泵，自动进样器，美国Waters公司）；CP225D型十万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）公司]；Millipore超纯水机（美国Millipore公司）。

米力农对照品（批号：101065-201001），5-羟甲基糠醛对照品（批号：111626-201509），米力农杂质I对照品（批号：101066-201001），米力农杂质II对照品（批号：101358-201501）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，天津科密欧）；其余试剂为分析纯。

米力农注射液（用葡萄糖调节渗透压的批号为16051，16221，14001，15105，15106；用氯化钠调节渗透压的批号为171001，201201，16088，17605）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 系统适用性溶液 取米力农、5-羟甲基糠醛、杂质I与杂质II对照品各适量，用流动相制成每1 ml中约含10，20，100与100 μg混合溶液，即得。

2.1.2 对照品溶液 混合对照品储备液：分别取5-羟甲基糠醛、米力农杂质I与杂质II对照品各适量，用流动相制成每1 ml分别含1，0.1，0.1 mg 混合溶液。

混合对照品溶液：取混合对照品储备液适量，用流动相制成每1 ml中分别含5-羟甲基糠醛、米力农杂质I与杂质II 10，1和1 μg混合溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液 取注射液，即得（浓度1 mg/ml）。

2.1.4 自身对照溶液 精密量取供试品溶液适量，用流动相制成每1 ml中含米力农2 μg溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱Shiseido C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水-甲醇-硼酸钠缓冲液（取硼酸31 g，加水800 ml，缓缓加20 %氢氧化钠溶液适量，充分振摇使硼酸完全溶解，用20 %氢氧化钠溶液调节pH 7.0，加水稀释至1000 ml，摇匀，即得。临用新制）（725:250:25）；5-羟甲基糠醛的检测波长为284 nm，米力农杂质I、杂质II、其他杂质的检测波长254 nm；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；进样量20 μl。

2.3 系统适用性试验

取系统适用性溶液、混合对照品溶液及供试品溶液，分别按2.2项下色谱条件测定。结果表明，在系统适用性溶液、混合对照品溶液及供试品溶液的284 nm的色谱图中，5-羟甲基糠醛峰与其相邻杂质峰的分离度符合要求；在254 nm的色谱图中，杂质I峰与米力农峰的分离度大于4.0，见图1～2。

2.4 专属性试验

精密称取5份样品[每份含米力农对照品25 mg，无水葡萄糖1.18 g（按处方比例）]，置入25 ml量瓶，分别加入1 mol/L氢氧化钠溶液5 ml，振摇使溶解，室温放置8 h，中和；加入1 mol/L盐酸溶液5 ml，振摇使溶解，室温放置8 h，中和；加入30 %过氧化氢溶液5 ml，振摇使溶解，室温放置0.5 h；加水5 ml，振摇使溶解，置水浴中破坏5 h，取出放冷；加水5 ml，振摇使溶解，4500 lx光照条件下照射72 h，再加入0.236 mg（按5-羟甲基糠醛的限度值计算的加入量）5-羟甲基糠醛，用流动相定容至刻度，摇匀。取上述各溶液作为破坏性供试溶液，按2.2项下条件进行测定。结果表明，本品在酸、碱、氧化、高温及光照条件下均有不同程度的破坏，在284 nm色谱图中各降解产物峰均能与5-羟甲基糠醛峰达到完全分离，在254 nm色谱图中各降解产物均能与主峰达到完全分离。色谱图见图3。

图1 254 nm波长下的系统适用性色谱图

图2 284 nm波长下的系统适用性色谱图

图3 米力农专属性色谱图

2.5 检测限和定量限

取对照品溶液及对照溶液，逐级稀释，当S/N为10时，5-羟甲基糠醛、米力农杂质I、杂质II、米力农的定量限分别为5 ng/ml，0.025 μg/ml，0.05 μg/ml，1 ng/ml；当S/N为3时，5-羟甲基糠醛、米力农杂质I、杂质II、米力农的检测限分别为2.5 ng/ml，0.01 μg/ml，0.025 μg/ml，0.3 ng/ml。

2.6 精密度试验

取对照品溶液，按2.2项下色谱条件连续进样6次，记录各色谱峰峰面积。分别计算5-羟甲基糠醛、米力农杂质I、杂质II峰面积的RSD分别为0.11 %，0.64 %，0.16 %，精密度良好。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液，按2.2项下色谱条件分别于0，2，4，6，8，10，12 h测定，记录各色谱峰峰面积。5-羟甲基糠醛、米力农杂质I、杂质II、其他单个最大杂质峰面积的RSD分别为0.10 %，1.1 %，1.1 %，1.2 %，供试品在12 h内稳定。

2.8 重复性试验

取同一批样品（批号16051）按2.1.3项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.2项下色谱条件分别进行测定，5-羟甲基糠醛、米力农杂质I、杂质II的平均含量分别为0.0010 %，0.013 %和0.063 %，RSD分别为0.07 %，1.07 %和0.94 %。

2.9 线性关系考察

取混合对照品储备溶液和供试品溶液适量，加流动相制成每1 ml中分别含米力农为0.2，0.5，1，2，3，5 μg，5-羟甲基糠醛1，2，5，10，20，50，100 μg，米力农杂质I及杂质II各为0.1，0.2，0.5，1，2，5，10 μg线性试验溶液。照2.2项下色谱条件测定，记录各色谱峰的峰面积。以浓度和相应峰面积进行线性回归，所得结果见表1。

表1 4种成分的线性关系

2.10 回收率试验

取对照品储备液适量，分别用已知各杂质含量的供试品溶液制成相当于杂质对照浓度的80 %，100 %，120 %溶液各3份，按2.2项下色谱条件进行测定，记录各成分色谱峰面积。分别计算各成分不同浓度的加样回收率及RSD，结果见表2～4。

2.11 耐用性试验

采用Waters 2695 2487高效液相色谱仪（紫外检测器，四元泵，自动进样器，美国Waters公司）、色谱柱Venusil MPC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），按2.2项下色谱条件进行系统适用性试验。结果表明，在254 nm波长的色谱图中，杂质I峰与米力农峰的分离度大于4.0，在284 nm波长的色谱图中5-羟甲基糠醛与其相邻杂质峰的分离度符合要求。色谱图见图4～5。

表2 5-羟甲基糠醛试验结果

表3 米力农杂质I试验结果

表4 米力农杂质II试验结果

2.12 样品测定

按2.1项下方法制备混合对照品溶液、供试品溶液和自身对照溶液，分别进样测定，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。在284 nm色谱图中5-羟甲基糠醛按外标法以峰面积计算，在254 nm色谱图中米力农杂质I和杂质II按外标法以峰面积计算，其他杂质均以自身对照法计算。样品测定结果见表5。

图4 254 nm系统适用性色谱图

图5 284 nm系统适用性色谱图

表5 样品测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择

参考ChP2015二部收载的含葡萄糖注射液的检测标准[9]，其5-羟甲基糠醛在HPLC检测中检测波长均为284 nm，通过紫外光谱扫描，5-羟甲基糠醛在284 nm波长处有最大吸收。最终确定5-羟甲基糠醛的检测波长为284 nm。米力农、米力农杂质I、杂质II及其他杂质的检测波长仍选择254 nm。

3.2 5-羟甲基糠醛限度的确定

参考ChP2015二部收载的含葡萄糖注射液检验标准[9]中的5-羟甲基糠醛限度、国内生产企业的处方及按新建立的方法测定的结果，最终将5-羟甲基糠醛的限度订为“不得过葡萄糖标示量的0.02 %”。

4 结论

本文所建立的HPLC法专属性良好，可有效排除用葡萄糖调节渗透压产品中5-羟甲基糠醛对有关物质测定结果的影响，同时又不影响用氯化钠调节渗透压产品的测定结果，为严格控制不同生产厂家生产的米力农注射液产品质量的控制提供依据。