麦冬皂苷B对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究

闫江涛，高立伟，左一凡

（平煤神马医疗集团总医院 肿瘤内科，河南 平顶山 467000）

结肠癌是消化道常见恶性肿瘤，研究表明我国传统中医药在结肠癌治疗中有明显的增效减毒的优势，具有抑制结肠癌细胞系体外生长、增强机体免疫功能及促进细胞凋亡的作用[1]。麦冬皂苷B是从中药麦冬中分离出的一种单体，研究表明其具有抗肿瘤作用，如麦冬皂苷B可诱导人肝癌HepG2细胞发生自噬[2]。麦冬皂苷B可能通过上调miR-34a的达抑制A549细胞增殖[3]。麦冬皂苷B可能通过激活JNK/c-Jun信号通路诱导细胞自噬、凋亡和细胞周期阻滞，从而抑制结肠癌的生长[4]。然而麦冬皂苷B影响结肠癌细胞增殖、凋亡的机制尚未完全清楚。有研究报道结肠癌组织中的微小RNA（miRNA）miR-142-3p的表达下调[5]。miR-142-3p高表达可在体内抑制结肠癌细胞的生长[6]。本研究旨在研究麦冬皂苷B是否通过调控miR-142-3p影响结肠癌细胞的增殖和凋亡。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取本院2017年1月～2019年1月经病理检测为结肠癌且具有完整临床病理资料的25例患者的癌组织及其相应癌旁组织，患者术前未进行过手术及放化疗，所有患者均知情且同意。

1.2 仪器

FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；Thermo FC酶标仪（美国Thermo公司）。

1.3 材料

结肠癌细胞HT29（上海圻明）；胎牛血清，RPMI-1640培养基（上海羽朵）；麦冬皂苷B（纯度≥97 %，上海谷研）；细胞计数试剂盒8（CCK-8，杭州仟诺）；凋亡检测试剂盒（上海经科）；RIPA蛋白裂解液（北京百奥莱博）；荧光定量PCR试剂盒（上海沪震）；cyclin D1抗体，cleaved-caspase-3抗体（美国Abbiotec公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体（IgG-HRP）（美国AAT Bioquest公司）。

1.4 细胞处理与分组

结肠癌细胞HT29用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液在37 ℃、5 % CO2培养箱培养，取对数生长期细胞，将其分别用10，20，40 μmol/L的麦冬皂苷B处理，正常培养的细胞作为对照（NC）组。

将miR-142-3p模拟物阴性对照（miR-NC）、miR-142-3p模拟物、miR-142-3p抑制剂阴性对照（anti-miR-NC）、miR-142-3p抑制剂（anti-miR-142-3p）转染至HT29细胞中，分别记为miR-NC组、miR-142-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-142-3p组；将anti-miR-NC、anti-miR-142-3p转染至HT29细胞后再用40 μmol/L的麦冬皂苷B处理，记为麦冬皂苷B+anti-miR-NC组、麦冬皂苷B+anti-miR-142-3p组。

1.5 CCK-8检测细胞增殖活力

选择各组转染后培养48 h细胞，每孔加入10 μl CCK-8试剂，孵育2 h后，酶标仪检测各组细胞450 nm波长处的吸光度（OD）值。

1.6 蛋白质印迹（Western blot）法检测cyclin D1、cleaved-caspase-3蛋白表达

提取各组细胞总蛋白，定量后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室温封闭90 min，加入cyclin D1和cleaved-caspase-3一抗，4 ℃孵育过夜，加入山羊抗兔IgG-HRP室温孵育2 h，暗室中曝光显影，定影，测定蛋白条带灰度值，以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白质相对表达水平。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

各组细胞培养48 h后用预冷的PBS漂洗2次，先加入10 μl 膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（annexin V-FITC），再加入5 μl 碘化丙啶（PI），混匀后避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-142-3p表达水平

各组细胞培养48 h后提取细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA，miR-142-3p以U6为内参进行PCR扩增，每个样品重复3次，循环条件为95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40个循环；60 ℃延长5 min。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。miR-142-3p上游引物序列：5'-GGGTGTAGTGTTTCCTACT-3'，下游引物序列：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6上游引物序列：5'-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGCAGC-3'，下游引物序列：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.9 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度麦冬皂苷B对结肠癌细胞HT29增殖的影响

与对照组相比，不同浓度麦冬皂苷B组结肠癌细胞HT29活性降低，cyclin D1相对表达水平显著降低（P＜0.05），结果见图1、表1。

图1 Western Blot检测cyclin D1蛋白的相对表达

表1 不同浓度麦冬皂苷B对结肠癌细胞HT29增殖的影响（ ±s，n=9）

表1 不同浓度麦冬皂苷B对结肠癌细胞HT29增殖的影响（ ±s，n=9）

注：与NC比较，*P＜0.05

组别 OD450 cyclin D1相对表达量NC 0.869±0.10 0.83±0.08 10 μmol/L 麦冬皂苷B 0.690±0.08* 0.72±0.07*20 μmol/L 麦冬皂苷B 0.513±0.04* 0.57±0.05*40 μmol/L 麦冬皂苷B 0.431±0.03* 0.38±0.04*F 72.342 88.909 P 0.000 0.000

2.2 麦冬皂苷B对结肠癌细胞HT29凋亡的影响

与对照组相比，麦冬皂苷B（40 μmol/L）组结肠癌细胞HT29中cleaved-caspase-3表达水平显著升高，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），见图2、表2。

图2 麦冬皂苷B对结肠癌细胞HT29凋亡的影响

表2 麦冬皂苷B对结肠癌细胞HT29凋亡的影响（ ±s，n=9）

表2 麦冬皂苷B对结肠癌细胞HT29凋亡的影响（ ±s，n=9）

注：与NC比较，*P＜0.05

NC 0.45±0.04 8.12±0.81麦冬皂苷B 0.93±0.09* 27.61±2.53*t 14.621 22.010 P 0.000 0.000

2.3 麦冬皂苷B对miR-142-3p表达的影响

与对照组相比，麦冬皂苷B组结肠癌细胞HT29中miR-142-3p表达水平显著升高（P＜0.05），见表3。

表3 麦冬皂苷B对miR-142-3p相对表达量的影响（ ±s，n=9）

表3 麦冬皂苷B对miR-142-3p相对表达量的影响（ ±s，n=9）

注：与NC比较，*P＜0.05

组别 miR-142-3p相对表达量NC 1.00±0.12麦冬皂苷B 3.27±0.30*t 21.076 P 0.000

2.4 miR-142-3p在结肠癌组织中表达情况

与癌旁组织相比，结肠癌组织中miR-142-3p表达水平显著降低（P＜0.05），见表4。

表4 miR-142-3p在结肠癌组织中相对表达量情况（ ±s，n=25）

表4 miR-142-3p在结肠癌组织中相对表达量情况（ ±s，n=25）

注：与癌旁组织比较，*P＜0.05

癌旁组织 1.00±0.11结肠癌组织 0.38±0.03*t 27.189 P 0.000

2.5 miR-142-3p对结肠癌细胞HT29增殖、凋亡的影响

与miR-NC组相比，miR-142-3p组miR-142-3p表达水平显著升高，cyclin D1表达水平显著降低，cleaved-caspase-3表达水平显著升高，细胞增殖活性降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与anti-miR-NC组相比，anti-miR-142-3p组miR-142-3p表达水平显著降低，cyclin D1表达水平显著升高，cleaved-caspase-3表达水平显著降低，细胞增殖活性升高，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），见图3，表5。

2.6 miR-142-3p低表达对麦冬皂苷B对结肠癌细胞HT29增殖和凋亡的影响

与麦冬皂苷B+anti-miR-NC组相比，麦冬皂苷B+anti-miR-142-3p组miR-142-3p表达水平显著降低，cyclin D1表达水平显著升高，cleaved-caspase-3表达水平显著降低，细胞增殖活性升高，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），见图4，表6。

图3 Western Blot检测cyclin D1、cleavedcaspase-3蛋白的相对表达

图4 Western Blot检测cyclin D1、cleavedcaspase-3蛋白的表达

表5 miR-142-3p对结肠癌细胞HT29增殖、凋亡的影响（ ±s，n=9）

表5 miR-142-3p对结肠癌细胞HT29增殖、凋亡的影响（ ±s，n=9）

注：与miR-NC比较，*P＜0.05；与anti-miR-NC比较，#P＜0.05

组别 miR-142-3p相对表达量cyclin D1相对表达量cleaved-caspase-3相对表达量 OD450 凋亡率/%miR-NC 1.00±0.11 0.85±0.08 0.46±0.05 0.857±0.12 8.09±0.81 miR-142-3p 3.28±0.30* 0.40±0.04* 0.95±0.09* 0.526±0.08* 21.49±2.01*anti-miR-NC 1.03±0.11 0.82±0.07 0.44±0.04 0.866±0.10 7.98±0.72 anti-miR-142-3p 0.48±0.04# 1.17±0.12# 0.15±0.02# 0.937±0.14# 3.23±0.27#t 483.801 131.604 314.476 24.143 420.824 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表6 miR-142-3p低表达对麦冬皂苷B对结肠癌细胞HT29增殖和凋亡作用的影响（ ±s，n=9）

表6 miR-142-3p低表达对麦冬皂苷B对结肠癌细胞HT29增殖和凋亡作用的影响（ ±s，n=9）

注：与麦冬皂苷B+anti-miR-NC比较，*P＜0.05

组别 miR-142-3p相对表达量cyclin D1相对表达量cleaved-caspase-3相对表达量 OD450 凋亡率/%麦冬皂苷B+anti-miR-NC 1.00±0.08 0.34±0.03 0.90±0.08 0.428±0.05 26.76±2.49麦冬皂苷B+anti-miR-142-3p 0.42±0.04* 0.72±0.07* 0.55±0.04* 0.715±0.09* 9.68±0.83*t 19.454 14.969 11.739 8.363 19.522 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

目前的化学药物治疗结肠癌仍具有严重的毒、副作用，开发毒性低、副作用小的抗结肠癌药物是研究的重点和热点，而中草药的有效活性成分是筛选抗癌药物的重要来源，中药治疗结肠癌也逐渐成为了人们关注的重点[7-8]。研究报道麦冬皂苷B通过LINC00668/miR-432-5p上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）轴抑制A549细胞的转移[9]。麦冬B素可在体内和体外抑制A549细胞的转移和血管生成[10]。麦冬皂苷B抑制人胃癌细胞SGC-7901增殖，促进细胞凋亡[11]。本研究结果显示，麦冬皂苷B处理的结肠癌细胞HT29活性降低，cyclin D1表达水平显著降低，cleaved-caspase-3表达水平显著升高，细胞凋亡率显著升高；cyclin D1是细胞周期相关蛋白，可影响细胞增殖；且研究报道cyclin D1在结肠癌中过度表达，与结肠癌的临床病理特征紧密相关[12]。表明麦冬皂苷B可抑制结肠癌细胞HT29增殖，促进细胞凋亡。

研究报道miR-142-3p过表达抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡[13]。miR-142-3p高表达可抑制乳腺癌细胞系的生长和转移[14]。本实验结果显示，miR-142-3p在结肠癌组织中低表达，miR-142-3p高表达可抑制结肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡。miR-142-3p低表达可促进结肠癌细胞增殖、抑制细胞凋亡。说明miR-142-3p在结肠癌中起抑癌作用。研究报道，通过上调miR-142-3p增强了结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）的敏感性[15]。本研究结果表明，麦冬皂苷B处理的结肠癌细胞HT29中miR-142-3p表达水平显著升高，而miR-142-3p低表达可抑制麦冬皂苷B对结肠癌细胞HT29增殖和凋亡的影响。说明麦冬皂苷B可能通过调控miR-142-3p影响结肠癌细胞的增殖、凋亡。

综上所述，麦冬皂苷B可通过上调miR-142-3p的表达抑制结肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡，为结肠癌的中药治疗提供新思路和理论依据。