尾气检测在泰乐菌素发酵中的作用

徐有斌，章海红

（浙江海正药业股份有限公司，浙江台州 318000）

泰乐菌素是从弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）的培养液中获得的一种大环内酯类抗生素，对多种革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，还对部分革兰氏阴性菌、弯杆菌、螺旋体有抑制作用，并具有抗球虫作用，已被广泛应用于畜牧业的畜禽疾病防治或作为促生长的饲料添加剂。

泰乐菌素由微生物发酵培养获得，在泰乐菌素发酵代谢过程中，产生的尾气中包含大量CO2及剩余的O2，通过质谱仪在线检测尾气中的CO2及O2，再经过计算获得发酵过程中的CO2释放速率（CER）、摄氧率（OUR）及呼吸熵（RQ）等呼吸代谢参数，可以很直观地反应菌体代谢的状况，在发酵种子移种条件、发酵过程状态识别、优化供氧水平、产率预测以及优化发酵工艺等方面都有一定的指导意义，并在生产应用中取得了良好的效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料

菌种为自有菌种，弗氏链霉菌。

1.2 主要设备

PrimaδB质谱仪，美国Thermo ONIX公司；24 m3种子罐和150 m3发酵罐，发酵罐配置在线pH及溶解氧（DO）均为梅特勒特利多公司生产；1260液相色谱仪，美国AGILENT。

1.3 发酵培养

种子培养温度32 ℃，培养结束后，按8%～15%移种量接入发酵罐进行培养，温度30 ℃培养，控制pH约7.0。

1.4 分析测试方法

效价采用HPLC测定，取发酵液样品至100 mL容量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，过滤。检测条件为：波长280 nm；色谱柱C18，4.6 mm×200 mm，5 μm或者相当；流动相为2 mol/L高氯酸钠∶乙腈=60∶40。

菌浓采用湿重法测定，10 mL发酵液在3 000 r/min条件下离心15 min；DO在移种后标定相对饱和度为95%；CER、OUR和RQ分别根据公式（1）～（3）计算，并均由计算机自动生成。

2 结果与分析

2.1 发酵种子移种条件

泰乐菌素发酵种子阶段，处于发酵的早期生长阶段，其中一个重要的生长指标为CO2的产生，通过分析尾气中的CO2含量，并结合pH、DO的变化趋势，可以很好地了解种子的生长状态，量化移种条件，便于操作人员进行操作。

图1为泰乐菌素种子生长阶段典型的趋势。由图可以看出生长过程中，pH与CER趋势具有明显的特征对应关系。种子培养前期，培养基中的淀粉类碳源会水解成葡萄糖，而葡萄糖作为碳源被菌体有氧呼吸利用并产生各种酸性物质，如丙酮酸及三羧酸（TCA）循环中各种中间代谢物。随着葡萄糖利用速度的逐渐增大，呼吸强度也相应上升，但因处于培养适应期，菌丝量较少，pH下降趋势不明显。中期，随着培养基中部分氮源氨基酸脱氨基后直接参与到菌丝生长代谢，此阶段会伴随NH4+的释放，从而导致pH上升并产生CO2。且由于菌丝大量产生，CER也明显升高。后期，CER变化趋势也同步pH的变化趋势，表现出一定的对应关系。

通常在大规模生产过程中，为了避免染菌，往往在种子培养阶段尽量减少发酵罐的各种死角。而通过利用发酵尾气检测，泰乐菌素种子阶段的生长趋势也能进行在线识别，是一种对发酵移种时机的把握更具数据化的手段。

图1 种子代谢趋势

2.2 发酵过程状态识别

泰乐菌素发酵具有典型的微生物发酵规律性，分为迟滞期、对数生长期、稳定期及衰亡期。以往一般通过发酵过程的DO/pH等趋势，结合镜检、菌丝浓度的检测进行判别，但是由于离线检测的时效性及精度，过程识别较为困难。在泰乐菌素发酵过程中，过程判断并进行控制的好坏，对发酵影响较大，通过引入尾气分析，对其中的CER、OUR及RQ进行分析，可以很好地区分发酵过程中的各个状态。

图2为泰乐菌素发酵较为典型的趋势，图3为泰乐菌素发酵代谢尾气分析趋势。结合图2及图3分析可以看到，发酵前期因菌丝利用淀粉类碳源分解成葡萄糖，进而进行有氧呼吸，产生各种有机酸，导致pH快速下降；泰乐菌素发酵前期生产速度很快，迟滞期时间相当短暂。之后随着菌体量大量繁殖，菌体利用酸性物质的速率加大，培养基中酸性物质的浓度逐渐降低，pH开始反弹。当pH反弹到一定程度时，淀粉类碳源的水解速度已与菌体对葡萄糖的需求有相当大的差距，为满足菌体生长的需要，菌体开始利用其他可利用的碳源，如有机氮源中谷氨酸（Glu）和丙氨酸（Ala）的氨基部分可用作氮源，而脱氨基后形成的酮酸部分可被菌体利用作为碳源，与此同时还会释放一定碱性物质NH4+，从而导致发酵液中的pH上升，从图3也可以看出此阶段RQ值有所上升。之后发酵液中可被菌体快速利用的有机氮源的量也是有限的，所以当pH上升到一定幅度后又缓慢下降，同时CER增长的趋势下降。所以泰乐菌素发酵尾气数据与pH的相关性，反映了基础培养基中的淀粉类水解速率与菌体对葡萄糖的利用速率之间与菌体利用不同的碳源导致的动态平衡。此阶段，尾气数据快速变动，同时也表明了菌丝的生长阶段进入快速生长期。当发酵进入40 h后，菌丝的呼吸强度（如CER及OUR）又开始逐步上升，且RQ值逐渐下降至0.7～0.8，此数值作为典型的菌体利用豆油的RQ值，基本上表明豆油已作为泰乐菌素发酵的唯一碳源，此阶段开始泰乐菌素效价快速增长，进入产素期。

从尾气数据看，中后期OUR及CER同比例有所下降，呼吸强度降低，表明菌丝过早进入衰亡期，具体表现在效价的增幅放缓。综合pH、DO以及OUR、CER、RQ的变化趋势，发酵操作人员很容易对泰乐菌素发酵的各个阶段进行很好的识别，从而指导各个阶段的精确控制以及发酵终点的判断。

2.3 优化供氧水平

泰乐菌素发酵采用豆油作为碳源，且作为典型的有氧发酵，在生产过程中，需要良好的供氧水平才能保障发酵的正常进行。为确保泰乐菌素发酵过程获得适当的溶氧，需控制泰乐菌素发酵过程的DO在临界氧浓度左右，避免因DO不足导致的代谢异常或者DO过高引起的能源浪费以及可能对菌丝造成的伤害。

根据图4中DO与尾气OUR数据的对应关系，可以很直观地确定临界氧浓度，因发酵段时间内的参数相对稳定，氧传递系数（KLa）也大致稳定。随着OUR升高，DO呈下降趋势；反之，OUR降低，则DO开始上升。当DO降低至临界氧浓度以下，则出现OUR变化趋势与DO一致的情况，即同时上升或下降。

2.4 产率预测

泰乐菌素发酵产素期间，主要碳源来源于豆油，OUR的变化趋势与效价增长有一定的关联性，从图3分析，OUR在发酵中后期下降，后期的效价增长幅度也变小，基于以上分析，在泰乐菌素发酵过程中，可以通过查看OUR的变化趋势，来获得产率的变化预测，从而及时提醒技术人员采取应对措施。

2.5 发酵工艺优化

图3 泰乐菌素发酵代谢尾气分析趋势

基于对OUR变化趋势与效价增长方面的关联性，为获得后期更好的效价增长，对发酵中后期的OUR进行干预。分析认为，发酵中后期氮源的不足会引起豆油代谢的减弱，因此在发酵培养基中增加适量的氮源，可以避免中后期OUR的下降。在试验过程中，将发酵培养基中的棉籽饼粉、鱼粉及玉米蛋白粉的含量同时提高0.2%左右，培养参数相同的情况下，效价增长的趋势如图5所示。将氮源含量提高后，虽然中期OUR的绝对值低于未调整时，但中后期OUR保持稳定并有一定的回升趋势，表现在发酵中后期效价的增长趋势未下降，相较于调整前，发酵罐效价提高了14.8%。在大规模生产中，泰乐菌素发酵代谢经常受原材料影响产生波动，通过监测尾气参数及时调整工艺控制，对稳定发酵生产水平有较大帮助。

图4 泰乐菌素发酵OUR与DO趋势

图5 改良前后泰乐菌素OUR与效价增长趋

2.6 其他方面的应用

尾气分析在发酵中还有其他方面的应用，如发酵染菌会引起OUR、CER 的异常变化，且根据染菌的种类，其OUR、CER 的趋势也不相同，掌握其染菌的种类与相应的尾气变化趋势，可以初步判断染菌的种类。

3 结论

通过分析泰乐菌素发酵中尾气参数的变化，结合发酵过程中常规的在线DO、pH等监测值，对泰乐菌素发酵种子移种条件判断、发酵状态识别、优化供氧水平、产率预测、工艺优化等方面起到很好的指导作用。且尾气在线监测取样点位于排气管，不影响发酵罐结构，不直接接触发酵液，无发酵染菌影响。相信在泰乐菌素或其他产品的发酵生产中引入尾气分析可以推动发酵技术水平的进步。