四种植物提取液对小麦赤霉病菌的抑制

2021-01-07许艳周婷张硕王芳刘松青

生物化工 2020年6期

许艳，周婷，张硕，王芳，刘松青

（成都师范学院化学与生命科学学院，四川成都 610000）

小麦赤霉病作为一种典型的小麦病害，每年都给世界范围内的小麦生产带来较大的损失[1]，在流行时期，病穗率达50%～100%，减产达到10%～40%。目前，对小麦赤霉病的防治主要从抗病育种、药剂防治、生物防治及其他防治措施等方面进行。由于农药的不断施用，病原菌的抗药性逐渐增强，再加上过量农药残留易引起环境污染，生物防治技术逐渐引起重视。植物内生菌因其特殊的生境及其生物多样性，已经被众多专家认为是植物病害生物防治的天然资源菌[2-4]。

近年来，国内在植物源杀菌剂方面已取得了许多成果。殷帅文等[5]的研究表明，黄花草木樨乙醇提取物对小麦纹枯病菌和番茄灰霉病菌两种菌有抑菌效果。石明旺等[6]发现凤尾兰植物提取液对小麦纹枯病菌有很好的抑菌效果。吴恭谦等［7］的研究表明，白头翁素对禾谷镰刀菌抑制作用很强。郭松等[8]的研究发现，香樟叶、黄杨和刺槐提取物对小麦白粉病病菌有良好的抑制活性。兰金荣等[9]研究结果显示，质量分数为75%的黄瑞香乙醇提取物对赤霉病及根腐病病原真菌抑菌效果较好,其抑菌率均达到50%以上。

本实验研究菟丝子、洋葱、银杏、鱼腥草4种植物的植物提取液对小麦赤霉病的抑制。银杏叶提取物作为天然物质，其广谱、高效的抗菌活性可有效用于食品的天然防腐或作为新型无副作用的抗菌药物等方面；洋葱含有各种有效的抑菌成分[10-13]，其提取物可抑制葡萄球菌属、链球菌属、弧菌、芽孢杆菌等多种微生物的生长；菟丝子的化学成分主要包括香豆精、黄酮、甾醇类、多糖等[14]，其提取物均具有一定的体外抗氧化活性[15]；鱼腥草具有抗菌、抗病毒、提高机体免疫力等作用[16]，其提取液中抑菌物质对卡他球菌、金黄色葡萄球菌、流感杆菌等有明显的抑制作用[17-18]。这4种植物均已被验证为药用植物，具有一定的抑菌作用。因此，本实验的目的在于对这4种常见植物进行研究，观察其植物提取液是否对病原菌产生抑制作用，找到适合做制剂的材料和合适的料液比，为丰富植物源的生防制剂品种以及开发植物源农药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

洋葱和鱼腥草购于四川省成都市温江区游家渡农贸市场，菟丝子和银杏采于四川省成都市温江区成都师范学院校内，供试部位分别为洋葱肉质鳞茎、鱼腥草根、菟丝子根尖、银杏叶。用于活化菌种的培养基为马铃薯培养基（PDA培养基）。小麦赤霉病菌，四川农业大学微生物实验室，保存于实验室。

1.2 不同提取液的制备方法

将实验材料置于烘干箱中60 ℃烘干，高速搅拌机26 000 r/min粉碎2 min，过60目筛备用；将粉末与去离子水（水提法）或乙醇（醇提法）装于10 mL EP管中浸提，料液比为1∶10（g∶mL）；将EP管放置于摇床中，180 r/min浸提24 h。静置后分别用真空抽滤机进行抽滤，收集滤液。将提取液于6 000 r/min离心10 min，取上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，收集浓缩液至10 mL EP管，密封，4 ℃冰箱中保存备用，即得水提液或醇提液。

1.3 纸片抑菌法

抑菌效果采用纸片抑菌法测定。具体方法为：（1）用打孔机将滤纸打成直径为5 mm的小圆片，在高温灭菌锅中，121 ℃灭菌15 min。（2）在超净工作台上将灭菌后的PDA培养基倒入无菌培养皿中，每皿15～20 mL。待冷却凝固后，将待试菌悬液分别用无菌移液管在无菌操作下取100 μL于培养皿中，用涂布棒将菌液涂布均匀。（3）用无菌镊子夹取浸透提取液的滤纸片（将滤纸片提前在提取液中浸泡15 min左右），在试管内壁沥去多余水分，使滤纸片所含提取液基本一致，然后将其贴在含菌平板上，每皿贴2片，每种提取液做3次重复，每种提取液根据浓度不同，再做不同的重复。（4）培养皿置26～32 ℃恒温培养 24～48 h，观察有无抑菌作用，并测量抑菌圈大小，比较抑菌效果，有抑菌圈出现记为有抑菌作用（+），无抑菌圈出现记为无抑菌作用（-）。抑菌直径d在9～13 mm是一个+，13～18 mm是2个+，≥18 mm为3个+。

1.4 抑菌试验

1.4.1 提取方法试验

参照“1.2”的方法，采用水提法和醇提法制备植物材料提取液，按照“1.3”的方法进行抑菌试验，记录抑菌效果。

1.4.2 料液比实验

选用抑菌效果好的提取方法，进一步进行料液比实验。将粉末和95%乙醇按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶50（g∶mL）的料液比，在无菌条件下加盖浸提，浸提方法同“1.2”。将各料液比下的提取液按照“1.3”的方法进行抑菌试验，记录抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对供试菌株的抑制作用

如表1所示，不同植物的醇提取液对供试菌株有不同程度的抑菌活性。其中，菟丝子醇提物和洋葱醇提物对供试菌株的抑菌效果较好，平均抑菌圈直径达（19.15±1.05）mm和（16.77±1.06）mm，银杏的醇提取物抑菌效果次之，抑菌圈直径为（11.55±0.68）mm，鱼腥草的醇提取物对供试菌株的抑菌效果不明显。4种植物醇提液的抑菌效果由大到小排序为：菟丝子醇提液＞洋葱醇提液＞银杏醇提液＞鱼腥草醇提液。菟丝子水提取物对供试菌株的抑菌效果较好，平均抑菌圈直径达（15.33±0.55）mm，洋葱水提取物和银杏水提取物对供试菌株的抑菌效果次之，鱼腥草的水提取物对供试菌株的抑菌效果不明显。4种植物水提液的抑菌效果由大到小排序为：菟丝子水提液＞洋葱水提液＞银杏水提液＞鱼腥草水提液。

表1 供试4种植物的提取液对供试菌株的抑菌活性

由以上结果可知，菟丝子和洋葱的水提物和醇提物对供试菌株有不同程度的抑菌活性，且菟丝子和洋葱的植物醇提液抑菌性均优于水提液，银杏的水提液和醇提液抑菌效果趋同，鱼腥草的水提液和醇提液均没有体现抑菌性。

2.2 不同料液比的醇提取液对供试菌株的抑菌效果

如表2所示，4种植物的不同料液比醇提取液对供试菌株有不同的抑菌活性。其中，4种植物在料液比为1∶20时，抑菌效果都是最好的，1∶10料液比下抑菌效果次之，1∶30和1∶50料液比下抑菌效果不明显。

在1∶20料液比下，菟丝子和洋葱醇提取液对供试菌株的抑菌效果较好，平均抑菌圈直径分别为（21.05±0.65）mm和（18.95±0.55）mm；银杏醇提取液抑菌效果次之，平均抑菌圈直径为（10.55±0.68）mm；鱼腥草醇提液没有明显抑菌效果。4种植物1∶20料液比下醇提液的抑菌效果由大到小排序为：菟丝子醇提液＞洋葱醇提液＞银杏醇提液＞鱼腥草醇提液。

菟丝子、洋葱、银杏的植物提取液对小麦赤霉病菌具有一定的抑菌效果，而鱼腥草没有体现抑菌性。黄亮等[19]对鱼腥草叶、茎、根提取液进行了抑菌试验。结果表明，鱼腥草叶具有较强的抑菌活性，茎次之，而鱼腥草根几乎没有抑菌活性。本实验鱼腥草提取液没有抑菌活性是由于选取的材料为鱼腥草根，实验现象符合黄亮等的实验结果。

表2 4种植物的不同料液比醇提取液对供试菌株有不同的抑菌活性

菟丝子和洋葱的醇提取液抑菌效果明显优于水提取液抑菌效果。熊素英[20]在石榴皮抑菌液的制备及抑菌特性研究中表明，乙醇提取液优于水提取液且乙醇提取液对微生物有较好的抑制。蒋益虹[21]在荷叶抑菌活性成分的研究中采用不同极性溶剂分离得到的荷叶各提取物中，得出乙醇部位提取得率最高，抑菌活性最强，且乙醇提取液在低温下可以快速浓缩。这与本实验醇提取液抑菌效果明显优于水提取液抑菌效果的实验结果一致。可能原因是天然植物中含有的多种抑菌活性成分：如银杏叶提取物中的黄酮苷、萜内酯，鱼腥草和菟丝子提取物中的黄酮类大多数为脂溶性成分，用水提法制备不能充分提取。供试菌株的抑菌效果并不是随料液比越高越好，通过表2可以看出当料液比为1∶20（g∶mL）时抑菌效果最好，料液比为1∶10（g∶mL）时抑菌效果反而不明显。

菟丝子是入侵生物，具有寄主范围广、危害严重、扩散蔓延迅速、极难根除等特点，对于菟丝子的有效利用能变废为宝。在1∶20（g∶mL）料液比条件下，洋葱与菟丝子醇提液效果差别不大，考虑经济性，可选择菟丝子1∶20（g∶mL）醇提液开发抑菌制剂。