通过侧链结构修饰将三尖杉宁碱转化为紫杉醇的工艺研究

2021-01-07李健赖平安

生物化工 2020年6期

李健，赖平安

（1.桂林吉福思罗汉果有限公司，广西桂林 541006；2.桂林晖昂生化药业有限责任公司，广西桂林 541004）

紫杉醇（Paclitaxel）是从红豆杉科红豆杉属植物中分离得到的一种四环二萜生物碱，Schiff等[1]发现其在促进微管蛋白的聚合以及防止解聚具有良好的作用。美国食品和药物管理局（FDA）于1992年正式批准其用于临床治疗晚期卵巢癌，之后其临床应用范围逐渐扩展至乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌等多种癌症的治疗，是多年来治疗癌症的药物中疗效最为显著的化疗药物之一。

迄今为止，紫杉醇主要是从红豆杉属植物的枝叶或茎皮中提取得到，但由于红豆杉中的紫杉醇含量极低，纯天然来源的紫杉醇很难满足患者需求。为此，研究人员尝试开展了多种其他来源的紫杉醇制备方法的研究。其中，利用红豆杉中的杉烷类似物为前体，经过半合成方式获得紫杉醇及其衍生物是目前最有效的方法之一[2]。三尖杉宁碱（Cephalomannine，CE）是红豆杉中的紫杉烷类成分，其成分结构与紫杉醇的差异仅在C13位侧链上NH-的连接基团。在目前国内人工种植的主要红豆杉品种南方红豆杉中，三尖杉宁碱在树枝和树叶中的含量达392.69 μg/g和75.31 μg/g，远高于同部位中紫杉醇的含量77.03 μg/g和64.82 μg/g[3]。枝叶是紫杉醇提取可再生红豆杉资源的关键部位，人们在以南方红豆杉枝叶提取分离得到紫杉醇的同时，会得到比紫杉醇产量更大的主含三尖杉宁碱的副产物，如果能以简单且低成本的工艺将其转化为紫杉醇及其衍生物，将会大幅提高红豆杉资源的利用率，降低生产成本。

有专利提供了一种方法，将宁碱侧链的酰胺通过Schwartz's试剂转化为氨基[4-6]，然后酰化氨基获得紫杉醇及其他类似物，但该法使用的Schwartz's试剂较为昂贵，市场上并不容易获得，且反应条件要求很高，不利于实际的生产应用。本研究同样以紫杉烷侧链的酰胺基的裂解方法作为研究对象，发现以头孢菌素C为原料制备7-氨基头孢烷酸的化学裂解工艺原理[7]是可以被借鉴并应用在紫杉烷侧链酰氨基的裂解以获得可以被选择性酰化的活性氨基，并以此为基础，设计了对应的合成工艺，成功将三尖杉宁碱通过侧链的结构改造使之转化为紫杉醇。

1 合成路线设计

以三尖杉宁碱作为起始原料，通过三氯化铈作用对侧链的C2’-OH进行选择性苯甲酰化[8]，然后以氯甲酸三氯乙酯对C7-OH进行酰化使接上保护基团，再对侧链上的酰氨基进行卤化反应和醇解使获得活性氨基，然后通过提供适合的条件使C2’-O位的苯甲酰基发生重排反应迁移到氨基上，最后脱保护反应获得紫杉醇[9]。整个反应路线不需要引入昂贵的侧链，反应条件简单可控，可根据目标产物需求调整C2’-OH的酰化基团，实现氨基N-连接基团差异化的紫杉烷类似物的制备。具体的合成路线见图1。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

DLSB-20/40低温冷却循环泵，巩义市予华仪器有限责任公司；Waters2695高效液相色谱仪，沃特世科技有限公司（Waters）；IRPrestige-21傅立叶变换红外光谱仪，日本岛津；UV-3600Plus紫外分光光度计，日本岛津；液相色谱/安捷伦6140液质联用仪，安捷伦科技有限公司。

三尖杉宁碱色谱纯度98%，由桂林晖昂生化药业有限责任公司提供；苯甲酸酐、丙酮、氯甲酸三氯乙酯、五氯化磷、1,2-丙二醇、吡啶、三乙胺和锌粉为分析纯试剂，购买自百灵威公司。

2.2 2'-O-Bz-三尖杉宁碱的合成

图1

三尖杉宁碱50 g置干燥反应烧瓶中，加入400 mL经脱水处理的丙酮，搅拌溶解，加入1.25 g三氯化铈，搅拌20 min后加入15 g苯甲酸酐，加热使溶液温度升至40～50 ℃。搅拌3 h，TLC（展开剂：CHCl3∶CH3OH=20∶1）监测反应进度，待原料斑点完全消失，反应完毕。加入饮用水稀释后，以二氯甲烷萃取，有机层用水洗涤3次，分出有机层，浓缩；在浓缩液中加入200 mL石油醚，搅拌，静置分层，倾出上清液，沉淀物干燥，以丙酮/石油醚重结晶得微黄色干燥粉末A 59.5 g，转化率98%。产物在TLC展开剂条件下的Rf=0.64。产物氢谱数据为：1H-NMR（CDCl3，500MHz）：5.64（d，J=7.0Hz，1H）；3.85（d，J=7.0Hz，1H）；4.93（d，J=10.0Hz，1H）；2.54（ddd，J=6.9,9.5,15.0Hz，1H）；1.86（m）；5.55（m，1H）；6.31（s，1H）；6.21（t，J=8.0Hz，1H，）；2.3（m，1H）；1.14（s，3H）；1.26（s，3H）；1.86（s，3H）；1.79（s，3H）；4.32（d，J=8Hz，1H）；4.17（d，J=8Hz，1H）；5.65（d，J=2.8Hz，1H）；8.11（1H）；8.94（d，J=1Hz，2H）；6.35（m，2H）；7.92（t，J=6Hz，1H）；7.35～8.20（m，2H）；2.34（s，3H）；2.22（s，3H）；7.40～7.65（OBz）。波谱分析数据推断产物A为2'-O-Bz-三尖杉宁碱。

2.3 2'-O-Bz-7-Troc-三尖杉宁碱的合成

称取50 g产物A置反应烧瓶以250 mL二氯甲烷溶解，充入氮气，滴加吡啶32.5 mL。搅拌30 min，缓慢滴加氯甲酸三氯乙酯42.5 g，持续搅拌2 h，TLC监控反应进度（展开剂：CHCl3∶C2H5OAC=9∶2），待原料A斑点消失，停止反应。往反应混合溶液中加入0.5 mol/L盐酸水溶液250 mL，搅拌，静置分层，有机层再以250 mL/次的0.5 mol/L盐酸洗涤。分出有机层，减压浓缩，往浓缩液中加入150 mL石油醚，搅拌使石油醚与浓缩液混合均匀，静置，倒出上清液，底部沉淀物干燥，以丙酮/石油醚重结晶，得淡黄色粉末B 63.3 g，转化率97%。产物在展开剂CHCl3∶C2H5OAC=9∶2条件下TLC的Rf=0.71。产物氢谱数据为1H-NMR（CDCl3，500 MHz）：5.65（d，J=7.0Hz，1H）；3.95（d，J=7.0Hz，1H）；4.95（d，J=10.0Hz，1H）；2.54（ddd，J=6.9,9.5,14.9Hz，1H）；1.86（m）；5.65（m，1H）；6.35（s，1H）；6.17（t，J=8.0Hz，1H）；1.14（s，3H）；1.21（s，3H）；1.96（s，3H）；1.81（s，3H）；4.34（d，J=8Hz，1H）；4.17（d，J=8Hz，1H）；5.65（d，J=2.8Hz，1H）；8.15（1H）；8.95（d，J=1Hz，2H）；6.35（m，2H）；7.95（t，J=6Hz）；7.35～8.20（m，2H）；2.35（s，3H）；2.17（s，3H）；5.05（d，J=12，2H，OCOOCH2CCl3），7.40～7.65（OBz）。波谱分析数据与专利文献[10]一致，推断产物B为2'-O-Bz-7-Troc-三尖杉宁碱。

2.4 2'-O-BZ-7-troc-紫杉伯胺的合成

称取15 g五氯化磷置于干燥反应烧瓶中，加入150 mL二氯甲烷，冷却使溶液温度降至-15 ℃，搅拌，向烧瓶中滴加50 mL吡啶，搅拌反应约30 min。称取B产物50 g，以200 mL二氯甲烷溶解完全后缓慢加入反应烧瓶中，持续搅拌2 h。然后滴加1,2-丙二醇200 mL，加完后升高温度，控制温度在10 ℃反应，TLC（展开剂：CHCl3∶C2H5OAC=3∶1）监测反应进度，反应完毕，得到含有产物C（2'-Bz-7-Troc-紫杉伯胺）的反应混合液；产物在展开剂CHCl3∶C2H5OAC=9∶2条件下TLC的Rf=0.33。

2.5 7-Troc-紫杉醇合成

向含有产物C的反应混合液中加入250 mL二乙胺，使体系在碱性条件下搅拌反应2 h；TLC （展开剂：CHCl3∶C2H5OAC=3∶1）监控反应，待反应完毕，加入饮用水500 mL萃取，分出有机层，再以每次200 mL水洗涤3次，最后有机层再加入0.5 mol/L盐酸，中和至水层pH值到5～6，分出有机层，浓缩干燥，以200目硅胶进行层析分离，以乙酸乙酯∶石油醚=3∶7为洗脱剂洗脱，收集纯化层析液干燥得35.7 g D产物，“2.3”和“2.4”两步反应综合转化率为77.2%。产物在展开剂CHCl3∶C2H5OAC=9∶2条件下TLC的Rf=0.65。产物的氢谱数据为1H-NMR（CDCl3，500MHz）：5.68（d，J=7.0Hz，1H，C2-H）；3.95（d，J=7.0Hz，1H）；4.95（d，J=10.0Hz，1H）；5.55（m，1H）；6.25（s，1H）；6.20（t，J=8.0Hz，1H）；1.17（s，3H）；1.26（s，3H）；1.85（s，3H）；1.84（s，3H）；4.36（d，J=8Hz，1H）；4.18（d，J=8Hz，1H）；4.85（d，J=3.0Hz，1H）；8.15（1H）；8.95（d，J=1Hz，2H）；6.36（m，2H）；7.95（t，J=6Hz，1H）；7.39-8.15（m，2H）；7.38～7.78（m，2H，NBz）；2.35（s，3H）；2.17（s，3H）；5.03（d，J=12，2H，OCOOCH2CCl3）。数据与专利文献[11]一致，确认产物D为7-Troc-紫杉醇。

2.6 7-Troc-紫杉醇脱保护反应

将“2.5”项获得的含D的7-Troc-紫杉醇反应产物的二氯甲烷溶液中加入80 mL 0.5 mol/L盐酸，搅拌，加入15 g锌粉，搅拌，水浴加热使在35 ℃反应2 h。TLC（展开剂：CHCl3∶C3OH=20∶1）监测反应，待原料斑点消失，反应完毕。过滤除去锌泥，滤液有机层用饮用水洗涤3次至水层呈中性，分出有机层，减压浓缩、干燥。得到产物以200目硅胶进行层析分离，以C2H5OAC∶CHCl3=2∶8为洗脱剂洗脱，收集纯化层析液，浓缩、干燥。干燥物以丙酮/石油醚重结晶得到白色晶体28.8 g，产物在展开剂CHCl3∶CH3OH=20∶1条件下的Rf=0.50，与紫杉醇对照品的Rf值一致；产物的液相色谱（流动相为甲醇∶乙腈∶水=22∶42∶36；色谱柱为HYPREPHS C18，5μm，250 mm×4.6 mm，λ=227 nm；流速为1.0 mL/min）分析图谱中与紫杉醇对照品的出峰时间一致，色谱纯度为98%，反应转化率为96%。产物的氢谱数据为1H-NMR（CDCl3，500 MHz）：5.67（d，J=7.0Hz，1H）；3.79（d，J=6.5Hz，1H）；4.49（d，J=9.0Hz，1H）；2.54（ddd，J=7.0,9.5,15.0Hz，1H）；1.88（ddd，J=2.0,12.5,14.6Hz，1H）；4.39（dd，J=7.5,11.0Hz，1H）；6.27（s，1H）；6.23（t，J=9.0Hz，1H）；2.35（dd，J=9.0,15.5Hz，1H）；2.28（d，J=9.0,15.5Hz，1H）；1.14（s，CH3）；1.24（s，CH3）；1.79（s，CH3）；1.68（s，CH3）；4.30（d，J=8.5Hz，1H）；4.19（d，J=8.5Hz，1H）；4.79（d，J=2.0Hz，1H）；5.78（dd，J=2.5,9.0Hz，1H）；7.00（d，J=9.0Hz，NH）；8.13（d，J=7.5Hz，OBZ）；7.38～7.52（m，OBZ）；7.61（t，J=7.5Hz，OBZ）；7.38～7.52（m，Ph）；7.38～7.52（m，Ph）；2.38（s，OAC）；2.23（s，OAC）。

根据以上测试的光谱数据分析，产物的结构与紫杉醇文献值[12～13]比较，二者基本一致，确认工艺合成的样品为紫杉醇。从起始原料三尖杉宁碱开始，至获得紫杉醇的综合转化率约为70.5%。

3 结果与讨论

3.1 工艺路线关键步骤分析

3.1.1 关于2'-O-Bz-三尖杉宁碱的合成

反应中的Ce3+在酰化反应体系中分别与C7-OH和C9=O形成特定螯合结构从而保护C7-OH不被酰化而只对C2’-OH位进行酰化的特性[8]，以很高的反应转化率获得C2’-O-Bz-三尖杉宁碱。

3.1.2 2'-O-Bz-7-Troc-三尖杉宁碱合成中羟基保护剂的选择

反应原料三尖杉宁碱结构中存在较高活性的C7-OH，为避免在后续的反应中出现复杂的副反应，对C7-OH的保护是必要的。有机合成中羟基保护基团通常有三氯乙氧羰基（-troc），三乙基硅基（-Si(C2H5)3），叔丁氧羰基（-BOC）等，其对应的常用保护剂分别为氯甲酸三氯乙酯、三乙基氯硅烷、BOC酸酐。考虑到工艺路线设计中的后续反应，特别是侧链酰胺基的卤化、醇水解反应条件下三乙基硅基（-Si(C2H5)3）、叔丁氧羰基（-BOC）不稳定，因此采用氯甲酸三氯乙酯作为保护剂更合理。

3.1.3 2'-O-BZ-7-troc-紫杉伯胺与7-Troc-紫杉醇的合成

侧链C3’位的戊烯酰胺进行裂解反应使形成活性氨基是关键步骤，本研究借鉴了头孢菌素C为原料经化学裂解法制备7-氨基头孢烷酸的工艺路线，利用五氯化磷对侧链酰胺基的C1”-O进行氯化取代反应形成亚胺结构，然后与1,2-丙二醇进行醚化形成亚胺醚化物，该亚胺醚化物在醇环境中发生醇解形成紫杉伯胺产物。由于氯化反应过程剧烈，反应需要在-10～15 ℃进行以减少副反应的发生。在氯化反应后，笔者曾经选择了甲醇、乙醇、正丁醇为醚化反应提供醇基，但反应转化率较低，采用1,2-丙二醇后获得了较高的得率，其原因仍有待进一步分析。

工艺路线中另一重要步骤是C2’-O位的苯甲酰基在前述醇裂解反应获得C3’-NH2后，在有机碱条件下发生重排转移至氨基上，该反应在相关研究中[4-6]已获得成功的应用。在本研究的工艺路线中，氯化反应体系中加入了一定数量的吡啶，因此酰基转移反应实际在伯胺形成时就已经缓慢发生，但加入二乙胺后对提高反应速度和转化率有很好的促进作用。

3.1.4 7-Troc-紫杉醇脱保护反应

对于羟基保护基（—Troc）的脱保护，常规的反应环境一般选择在甲醇中加入冰醋酸和锌粒（粉），这一反应环境有利于原料与酸、锌反应产生的氢的充分接触而实现脱保护。但笔者在研究中发现紫杉醇在甲醇加热条件下，C7-OH容易发生差向异构化变成7-表-紫杉醇，因此，在该步骤的脱保护反应中尝试了稀盐酸水溶液/二氯甲烷的两相反应体系。在搅拌足够充分的情况下，脱保护反应进行顺利，降低了目标产物紫杉醇的差向异构化风险。

3.2 工艺路线在合成其他紫杉烷类似物中的应用

本工艺路线的核心步骤是C3’位酰胺的裂解反应以形成活性的氨基C3’-NH2，而C2’-O位的酰基可根据目标产物的需要使用不同的酰化剂而获得对应的基团，并在执行后续酰基转移步骤时使其转移至氨基上。如要获得多烯紫杉醇在C3’位对应的叔丁氧甲酰胺基C3’-NH-BOC，则需要在对C2’-OH进行酰化时选择BOC酸酐作为酰化剂。

当然，反应获得活性氨基C3’-NH2后并不一定需要执行后续的C2’-O-位的酰基的转移步骤，也可在获得活性氨基后根据目标产物的需要对氨基直接进行酰化反应使形成酰胺基。