白芍成分治疗抑郁症的网络药理学研究

袁铭，刘向慧，张静晓，胡晓盈

（洛阳师范学院 食品与药品学院，河南洛阳 471934）

抑郁症是一种情感性精神障碍疾病，患者以显著而持久的心境低落、思维迟缓、意志活动减退为临床表现[1]。近30年间，抑郁症的发病率逐年上升，且呈低龄化趋势，严重影响人们的生活质量并对社会造成相当大的经济负担。目前，临床一线的抗抑郁药有选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂、去甲肾上腺素和特异性5-羟色胺能抗抑郁药等，主要针对中度以上抑郁症发作，且存在复发率高、副作用大等问题。近年来，中医药抗抑郁症研究逐渐受到人们的关注，如柴胡、厚朴、黄芩等，取得了较好的效果[2-3]。

白芍（Paennia lactiflora pall）为毛茛科植物芍药的干燥根，其味苦且酸，性微寒，归肝脾经，对人体有温血止痛、敛阴收津、平抑肝阳的疗效。白芍的主要活性成分有芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、苯甲酰芍药苷和芍药内酯苷等，有抗炎、止痛、抗氧化、抗心脑血管疾病及抑制自身免疫反应等多种药理作用。随着研究的不断深入，人们发现白芍中的白芍总苷具有良好的抗抑郁效果，其药理作用机制与5-HT神经功能相关[4]。

本研究采用网络药理学分析方法建立网络模型预测关于白芍治疗抑郁症的药理靶点。利用中药系统药理学数据库查询获得白芍化学成分，并通过吸收、分布、代谢和排泄（ADME）的有效标准评估筛选出具有良好药代动力学性质的活性成分。采用Cytoscape软件构成白芍活性分子-靶点通路数据网络构图，最后对靶点进行基因本体生物学过程（Gene Ontology Biology process，GO-BP）富集分析及基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。基于以上理论分析白芍分子作用于抑郁症疾病的药理作用机制，预测出与药理作用机制直接联系的有效靶点和通路。

1 材料和方法

1.1 白芍数据库构建

通过查询中药系统网络药理学数据库分析平台（TCMSP）、中国天然产物化学成分数据库（http://pharmdata.ncmi.cn/cnpc/）以及大量文献收集白芍化学成分以及相关数据。其中，大部分化学成分数据来自TCMSP数据库，并通过中国天然产物化学数据库和文献挖掘补充白芍的化学成分，最后根据所得化学成分数据，构建白芍化学成分数据库。

1.2 白芍活性成分筛选

通过以上中药数据库分析平台所搜集到的白芍化学成分，根据相关药代动力学参数，即口服利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）筛选白芍分子的活性成分[5]。由于抑郁症病理机制不仅与中枢神经系统有关，还与脑-肠轴的功能失调等相关，因此ADME/T参数中血脑屏障（BBB）在本研究中不作为活性分子的筛选条件。

1.3 白芍药物靶点预测

在白芍活性成分筛选的基础上进行药物靶点预测，本研究采用综合的靶点预测方法：通过成分名称或CAS号检索TCMSP、TTD数据库或采用SMILES号检索SEA数据库（http://sea.bkslab.org/）筛选白芍活性化学成分的作用靶点，进行活性成分潜在靶点数据集建立，并将筛选得到的靶点经过UniProt数据库查询转换为基因名称。

1.4 白芍网络构建

本研究白芍相关网络主要是“成分-靶点”网络的构建，深入研究白芍活性成分所对应靶点的作用机制。运用Cytoscape软件将收集的相关数据生成可视化网络，并结合数据库（疾病、通路、蛋白质）进行网络参数分析和生物功能注释[6]。网络构建可视化图中不同属性节点的联系并非是单一的，而是多项发散的，一个节点的度代表了白芍活性分子连接的靶点数目，这也证实了构图中一个节点可影响多个节点之间的信号交流，从而使得这种靶点作用机制呈现网络化。

1.5 基因本体论和通路富集分析

将白芍活性分子对抑郁症的作用靶点导入Metascape数据库，选择从三个方面对白芍活性成分与抑郁症的交叉作用靶点进行GO生物功能富集分析，同时选择KEGG通路富集进行靶点基因通路注释分析。基因本体论（GO）的分析又可以称为GO生物学功能富集分析，是一个在生物学领域中广泛用于基因功能分类的系统，主要用于描述基因产物的功能，一般分为三个部分：细胞组分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）、生物功能（Biological Process，BP）[7]。细胞组分主要分析研究基因产物在细胞中的位置；生物功能指的是与靶点基因密切的多步骤有序的生物功能，如细胞凋亡、细胞分化、信号传导等；分子功能则描述单基因产物的功能。KEGG是与通路相关的一个数据库，基于基因参与人体的各个通路而形成的数据库，也是对基因本身功能的注释。

2 结果与分析

2.1 白芍活性成分筛选

通过检索TCMSP、中药天然产物化学数据库结合文献查询，得出白芍119个化学成分，并通过两个关键参数OB和DL分析，共筛选出具有良好ADME性质的白芍活性分子16个，具体如表1所示。

以上筛选出的白芍活性成分中，有不少化合物已被证实具有多方面的药理作用。4-邻甲基芍药苷（OB=56.7，DL=0.43）和芍药苷（OB=53.87，DL=0.79）属于芍药总苷成分，被众多实验证实具有抗抑郁、抗炎、补血、抑制糖尿病和保护神经组织等药理学性质[8]；谷甾醇（OB=36.91，DL=0.75）已被研发成为一种药物，具有预防动脉粥样硬化、降低高脂血症的药理作用；山奈酚（OB=41.88，DL=0.24）已经被证明具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌等多种药理学作用。这些实验数据也证实了本研究所用网络构建模型的可靠性[9-10]。

表1 白芍活性成分筛选

2.2 白芍靶点预测

通过药代动力学参数筛选出16个活性成分，其中有7个活性成分目前靶点数目为0，借助SEA数据库预测白芍作用靶点，共得到184个靶点蛋白，利用Uniprot网站整理靶点信息。同时，检索GeneCards数据库[11]共查询11 479个靶点蛋白，选择关联度≥4.18，共得到1 946个与抑郁症关联度高的靶点。最后，对获得的白芍成分靶点和疾病靶点进行映射，选择两者中共有的靶点，将共有靶点和白芍活性成分进行映射，共得到白芍中与抗抑郁机制相关的75个靶点蛋白。

2.3 白芍成分-靶点网络分析

将白芍成分作用于抑郁症的靶点蛋白导入Cytoscape软件[12]，构建成分-靶点相互作用网络图，结果如图1所示。由图1可知，八边形代表白芍的有效成分，圆形代表靶点基因。构建网络图形时由degree值决定靶点有效成分图形的大小，成分联结靶点越多，则图形形状越大。由此可知，该网络有84个节点，其中9个成分节点，75个靶点基因节点。根据图1可知，白芍有效成分抗抑郁症排名前四的有谷甾醇、芍药二酮、4-邻甲基芍药苷以及山奈酚，这些成分可能是白芍抗抑郁的关键性活性成分。在有效成分中关联度较大的节点有AR（雄激素受体）、ESR1（雌激素受体1）和CYP19A1（细胞色素P450家族19亚家族A成员1）等靶点，这些靶点可能在白芍治疗抑郁症中起到重要作用。

图1 白芍活性成分-靶点网络图

2.4 GO富集分析

将白芍对抑郁症发挥作用的75个基因靶点导入Metascape软件，进行基因本体功能分析[13]。通过Metascape软件自动筛选出靶点蛋白在分子功能、生物进程、细胞组分3个方面联系较密切的通路途径分别有19条目、20条目、16条目。结果表明，白芍对抑郁症作用的靶点蛋白在分子功能方面，与类固醇结合（Steroid binding）、血红素结合（Heme binding）、蛋白质酪氨酸激酶活性（Protein tyrosine kinase activity)作用最为显著，这三个途径分别涉及12、11、11个作用靶点，如图2所示。同时与抑郁症作用相关其他单分子基因的表达途径还有生长因子受体结合（Protein tyrosine kinase activity）、激酶或激素结合（Kinase or Hormone binding）、单胺跨膜转运蛋白活性（Monoamine transmembrane transporter activity)、蛋白质均二聚活性（Protein homodimerization activity)、SH2域绑定（SH2 domain binding)等。结果显示，激素水平的调节（Regulation of hormone levels）是白芍治疗抑郁症最重要的生物过程，其通路过程与24个作用靶标相联系，是生物过程中靶标连线最多的途径，如图3所示。此外，丝裂原活化蛋白激酶级联反应的正调控（Positive regulation of MAPK cascade）、对脂多糖的反应（Response to lipopolysaccharide）和细胞对有机环状化合物的反应（Cellular response to organic cyclic compound）对抑郁症的影响仅次于激素调节，这些生物过程所连靶标及富集百分度已达到80%以上。细胞中的靶点作用集中于膜筏（Membrane raft）、受体复合体（Receptor complex）、突触前膜的组成部分（Integral component of presynaptic membrane）和溶泡（Lytic vacuole）等介质的传导，如图4所示。通过多方面分析可知，白芍对抑郁症的靶点作用可调控以上途径达到治疗效果。

2.5 KEGG通路分析

将75个潜在作用靶点映射到Metascape数据库中，进行KEGG通路富集分析，得到16个与抗抑郁作用机制密切相关的信号通路，详细如表2所示。KEGG结果显示，癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用这4个通路是最为显著的途径，也是白芍治疗抑郁症最有依据的作用通路，其中有18个靶点蛋白参与癌症通路的相关基因调控，也是靶点蛋白联系最多的通路传导途径。此外，癌症的中央碳代谢、内分泌抵抗、Th17细胞分化和MAPK信号通路是仅次于以上4个通路的传导途径，皆有7个靶点蛋白联系作用。

图2 GO富集分子功能分析图

图3 GO富集生物进程分析

图4 GO富集细胞组分分析图

表2 白芍抗抑郁作用的KEGG富集通路靶点信息表

2.6 蛋白质作用（PPI）网络构建

采用Metascape软件对靶点蛋白进行GO分子功能富集分析，使用数据库BioGrid 6、InWeb_IM 7、OmniPath 8进行蛋白质-蛋白质相互作用富集分析[14-15]。网络中密切关联的蛋白质形成蛋白质子集，如果网络包含3 ～500种蛋白质，则应用分子复杂检测（MCODE）算法9来识别密集连接的网络组件。本研究收集单个基因列表确定的MCODE网络，如图5所示。途径和过程富集分析已分别应用于每个MCODE组件，并且保留了按p≥3的最佳得分项作为相应组件的功能描述。

图5 蛋白质相互作用网络图集

由图5可知，INSR（Insulin Receptor，胰岛素受体）与7个靶点蛋白相互作用，分别是SRC（SRC Proto-Oncogene，Non-Receptor Tyrosine Kinase SRC，原癌基因，非受体酪氨酸激酶）、NTRK1（Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 1，神经营养受体酪氨酸激酶1）、VEGFA（Vascular Endothelial Growth Factor A，血管内皮生长因子A）、PLCG1（Phospholipase C Gamma 1，磷脂酶Cγ1）、EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor，表皮生长因子受体）、KIT（KIT Proto-Oncogene，Receptor Tyrosine Kinase，原 癌 基因，受体酪氨酸激酶）和JAK2（Janus Kinase 2，酪氨酸蛋白激酶JAK2）。SRC基因也与7个靶点相互作用，除去以上提到的6个靶点蛋白外，还与RET（Ret Proto-Oncogene，Ret原癌基因）协同作用。CYP家族（细胞色素P450）蛋白间相互联系，参与了甾体激素的合成，甾体激素的含量在抑郁症治疗中起到重要作用。OPRD1（Opioid Receptor Delta 1，阿片受体 Delta 1）、ADORA1（Adenosine A1 Receptor，腺苷A1受体）、CCR4（C-C Motif Chemokine Receptor 4，CC Motif趋化因子受体4）、OPRM1（Opioid Receptor Mu 1，阿片受体Mu1）和HRH3（Histamine Receptor H3，组胺受体H3）这5个靶点蛋白之间相互作用，每个靶点均与其他4个靶点连接。ESR1（Estrogen Receptor 1，雌激素受体1）和IL6（Interleukin 6，白介素6）都有3个靶点联系，这两者之间也相互作用。

3 结论

本研究运用网络药理学方法分析了白芍分子作用于抑郁症靶点的药理机制，构建了成分-靶标蛋白相互作用网络图，并通过基因功能的分析和通路分析，阐述了白芍分子抗抑郁症的多种分子作用机制，共得到以下5个结论，为研究白芍抗抑郁症的临床研究和创新药物提供了理论依据和科学支持。

（1）检索白芍相关数据库共收集119个白芍化学成分，以OB值和DL值筛选出16个白芍潜在有效成分，如芍药苷、4-邻甲基芍药苷、山奈酚、儿茶素、谷甾醇和丁子香萜等。

（2）预测得到75个白芍活性分子作用的抑郁症相关靶点蛋白，如INSR、CYP19A1、RET和NTRK1。

（3）利用白芍活性分子与其作用的抑郁症潜在靶点，建立成分-靶点网络。芍药二酮、4-邻甲基芍药苷和芍药苷等都是白芍活性成分中治疗抑郁症的关键成分；靶点AR、ESR1和CYP家族等靶点是白芍抗抑郁症的关键靶点。

（4）GO富集分析和KEGG通路分析结果可得，白芍治疗抑郁症调节的关键通路主要有类固醇结合通道、血红素结合通道、癌症通路治疗通道、生长因子受体结合和单胺跨膜转运蛋白活性等通道。

（5）PPI蛋白质相互作用关系表明白芍作用于抑郁症靶点可以通过细胞膜内CPY家族对激素水平的调节以及其他受体的调节达到抑郁症治疗的期望疗效。