miR-34a-Sirt1-NRF2信号通路对脑缺血损伤后内源性神经干细胞增殖的影响

廖 伟 蔡崇明 王海彬 程 伟 曾照彬 杨少春

赣南医学院第一附属医院神经外科，江西赣州 341000

脑缺血疾病是一种可导致神经元不可逆性损伤、坏死的脑血管疾病，严重威胁人类健康。现有的溶栓、神经营养治疗等方式对于脑缺血损伤的治疗效果有限。据统计，高达75%的脑缺血损伤患者存有不同程度的神经功能障碍，如何修复脑缺血损伤后导致的神经功能障碍成为目前治疗的难点[1]。目前在临床上，内源性神经干细胞是脑缺血损伤治疗的一个突破点，提高内源性神经干细胞的数量能够治疗脑缺血损伤[2]。有研究证实[3-4]，miR-34a 能通过沉默信息调节因子1（Sirt1）调控外源性神经干细胞增殖。但其是否参与调控脑缺血损伤后内源性神经干细胞的增殖，目前国内外尚未见相关报道。为此，本研究通过观察大鼠脑缺血损伤后miR-34a 及其靶基因Sirt1、核因子E2 相关因子2（NRF2）等的表达情况，并利用激活Sirt1 的表达，观察其上游miR-34a 及下游NRF2 的表达变化，进一步探讨miR-34a-Sirt1-NRF2 通路调控脑缺血损伤后内源性神经干细胞增殖过程，以进一步揭示脑缺血损伤后内源性神经干细胞的信号调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择50只健康成年雄性SD大鼠（购自赣南医学院实验动物中心，合格证号：021-96-02），体重200～300 g，8 周龄。饲养环境：自由喂养，不限制饮食，室温（20±2）℃，湿度（60±10）%，光照时间12 h（8∶00～20∶00）。本研究经相关实验动物伦理委员会审核通过。

1.2 主要仪器及试剂

FL40S.BLB Toshiba 荧光显微镜（日本东芝机械株式会社）、ABI 7900HT Fast 实时荧光定量PCR系统（美国应用生物系统ABI公司）、Chemilmager5500 自动电泳凝胶成像分析系统（美国AlphaInnotech公司）、Ts2-FL 倒置显微镜（日本尼康株式会社）、FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）、3-30K 台式低温超速离心机（德国希格玛Sigma 实验室离心机公司）；白藜芦醇试剂（上海梯希爱化成工业发展有限公司、生产批号501-36-0）。

1.3 实验分组及方法

在50只健康成年雄性SD大鼠中，将10只设为对照组，仅暴露动脉，不做缺血处理。另外40只大鼠参考文献[3]制备改良局灶性大脑中动脉栓塞（MCAO）脑缺血损伤模型：常规消毒铺巾，4%水合氯醛按1 mL/100 g 腹腔注射，正中颈部切口，分离并暴露右侧颈总、颈外、颈内动脉，结扎颈外动脉及其分支，于颈外、颈总动脉近心端，颈内动脉远心端分别留置动脉夹夹闭，于颈外动脉近分叉处剪一“V”字形切口，插入制备好的栓线，扎紧备线，松开颈内动脉远心端动脉夹，使线栓入颈内动脉，插入深度在180～200 mm，阻断大脑中动脉血液供应，松开颈总动脉动脉夹，线栓外留1 cm；待缺血2 h后，将线栓拔出，电凝颈外动脉断端，松开颈总动脉结扎线，实现再灌注，缝合皮肤切口，术中室温保持在（23±2）℃。麻醉清醒后大鼠出现以左前肢为主的偏瘫作为模型成功的标志，将造模成功的40只大鼠分为白藜芦醇组（n=10）、脑缺血1 d组（n=10）、脑缺血3 d组（n=10）、脑缺血7 d组（n=10），其中，白藜芦醇组每日经腹腔注射白藜芦醇，剂量30 mg/kg，每日1次。对照组在手术当天处死并取材，脑缺血1 d组、脑缺血3 d组、脑缺血7 d组在造模第1、3、7 天以及白藜芦醇组在造模第7 天处死并取材。

1.4 检测指标

1.4.1 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测miR-34a mRNA 的相对表达水平 应用RT-PCR 法检测各组大鼠室管膜下区miR-34a mRNA 的相对表达水平。具体操作：严格按照Trizol reagent 说明书提取室管膜下区脑组织总RNA，依照OD260/OD280 比值，估测RNA质量（比值在1.8～2.0 之间，满足实验要求），-80℃保存备用。取100 ng 总RNA、miRNA 茎环引物，逆转录试剂盒进行逆转录。采用SYBR GreenI Real-time PCR Master Mix 试剂盒进行RT-PCR 检测miR-34amRNA的相对表达量。

1.4.2 Western blotting 法检测Sirt1、NRF2 蛋白的相对表达量 取各组大鼠室管膜下区脑组织，加入适量冷裂解缓冲液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、苯甲基磺酰氟化物混匀，离心处理（转速3000 r/min，离心半径4 cm，离心时间10 min）取全蛋白提取物，滴加兔抗人Sirt1 单克隆抗体、NRF2 兔单克隆抗体。随后应用ECL 化学发光试剂盒检测杂交信号，曝光后扫描胶片，使用Image J 软件分析各蛋白条带的灰度值，以β-actin 蛋白作为内参，计算出相应的目标蛋白条带的灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值，即为Sirt1、NRF2 目标蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，任意两组间比较采用LSD-T检验，P＜0.05 为差异存在统计学意义。

2 结果

与对照组比较，白藜芦醇组、脑缺血1 d组、脑缺血3 d组、脑缺血7 d组miR-34a mRNA 相对表达量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与白藜芦醇组比较，脑缺血1 d组、脑缺血3 d组、脑缺血7 d组miR-34a mRNA 相对表达量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与脑缺血1 d组比较，脑缺血3 d组、脑缺血7 d组miR-34a mRNA 相对表达量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与脑缺血3 d组比较，脑缺血7 d组miR-34a mRNA 相对表达量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 各组miR-34a mRNA 和Sirt1、NRF2蛋白相对表达量的比较（±s）

表1 各组miR-34a mRNA 和Sirt1、NRF2蛋白相对表达量的比较（±s）

与对照组比较，aP＜0.05；与白藜芦醇组比较，bP＜0.05；与缺血1 d组比较，cP＜0.05；与缺血3 d组比较，dP＜0.05

组别例数 miR-34a mRNA Sirt1 蛋白 NRF2 蛋白对照组白藜芦醇组脑缺血1 d组脑缺血3 d组脑缺血7 d组10 10 10 10 10 1.09±0.88 2.13±0.92a 3.21±1.04ab 4.68±1.39abc 6.14±1.75abcd 2.91±0.24 2.50±0.46a 2.01±0.32ab 1.58±0.56abc 1.04±0.51abcd 3.35±0.42 2.99±0.54a 2.50±0.89ab 2.06±0.65abc 1.01±0.37abcd

3 讨论

目前在临床上，内源性神经干细胞再生疗法是脑缺血损伤治疗方法之一。正常生理情况下，内源性神经干细胞处于“休眠”的状态，但脑缺血损伤后，内源性神经干细胞能够定向增殖分化并靶向迁移至脑缺血损伤部位，修复受损神经[6]。室管膜下区是哺乳动物颅内最大的神经壁龛，此处聚集着较多的内源性神经干细胞，但正常情况下内源性神经干细胞数量有限，脑缺血损伤后仅仅依靠激活正常数量的内源性神经干细胞是远远不够的，因此如何提高神经干细胞的数量是当前研究的热点及难点[7]。相关研究表明[8]，脑缺血损伤后，内源性神经干细胞的增殖受诸多因素调控，外源性输入促红细胞生成素、神经生长因子等均可促进脑缺血损伤后内源性神经干细胞的增殖，但其具体调控机制尚不明确。王瑞彤等[9]的研究发现，在哺乳动物的胚胎发育阶段，大脑内有包括miR-34a、miR-126、miR-200b 等在内大量miRNA 的表达，提示miRNAs 在中枢神经系统的发育过程中以及对神经干细胞命运的调控过程中发挥了重要的作用。

miR-34a是一种高度进化保守的miRNA，相关文献报道[10]，miR-34a 能够通过调节基因及蛋白的表达，参与神经细胞的增殖及分化，在神经系统疾病的发生发展过程中发挥独特的调控作用。同时体外研究发现[11]，在包括胚胎干细胞、神经干细胞等干细胞的增殖分化过程中，miR-34a 能够促使胚胎干细胞、神经干细胞进一步增殖并分化为神经元等终末神经细胞，在胚胎干细胞、神经干细胞的增殖分化过重中起着重要的作用。

Sirt1是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白去乙酰化酶，参与了体内许多生理功能的调节[12]。姬红培等[13]研究发现，Sirt1 在胚胎干细胞定向分化的神经干细胞中表达，在轻度氧化或高表达Sirt1 的情况下能够促使胚胎干细胞定向分化的神经干细胞分化，而抑制Sirt1 表达则对于维持神经干细胞的增殖具有促进作用。赵忠惠等[14]同样发现，Sirt1是神经保护的重要作用因子。NRF2 核因子是一种调节细胞内氧化还原平衡的关键转录因子，作为Sirt1 的下游基因，与Sirt1 协同参与包括众多基因转录、能量代谢以及细胞增殖的过程。众多研究已证实[15]，Sirt1 作为miR-34a 的靶基因能够参与干细胞的增殖与分化，而miR-34a可通过Sirt1/NRF2 通路一定程度修复心肌及肝脏的缺血再灌注损伤。本研究结果也显示，与对照组比较，白藜芦醇组、脑缺血1 d组、脑缺血3 d组、脑缺血7 d组miR-34a mRNA 相对表达量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与白藜芦醇组比较，脑缺血1 d组、脑缺血3 d组、脑缺血7 d组miR-34a mRNA 相对表达量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与脑缺血1 d组比较，脑缺血3 d组、脑缺血7 d组miR-34a mRNA 相对表达量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与脑缺血3 d组比较，脑缺血7 d组miR-34a mRNA 相对表达量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明了miR-34a 有可能通过调节Sirt1/NRF2 通路来调控脑缺血损伤后内源性神经干细胞增殖过程。