辅助生殖技术中卵母细胞滑面内质网聚集研究进展

姜经航 综述 江梅 审校

荆门市第二人民医院生殖医学中心，湖北 荆门 448000

人类辅助生殖技术为了获得一定数目的卵母细胞，会使用促排卵药物，其有可能导致卵细胞周围微环境的改变，引起卵母细胞的形态变化，进而导致胚胎发育异常。不同于自然周期中卵母细胞核和细胞质成熟是同步的，促排卵周期可能出现不同步，卵母细胞胞浆出现多种形态异常。卵母细胞滑面内质网聚集(aggregates of smooth endoplasmic reticulum，SERa) 就是卵母细胞形态异常的一种。2011 年欧洲人类生殖与胚胎学学会(Alpha/ESHRE)专家共识建议丢弃含有SERa卵母细胞[1]。然而，2015年一项基于欧洲生殖医学中心的调查数据显示，只有48%的中心接受2011 年Alpha/ESHRE 共识建议[2]。2017 年Alpha/ESHRE修订后指出根据病例个体化选择，再次给出一个模糊处理方式[3]。鉴于对于SERa 的卵母细胞的处理意见不统一，本研究就国内外对含有SERa 卵母细胞的研究进行综述，为临床决策提供证据支持。

1 滑面内质网在卵母细胞的结构与功能

滑面内质网(smooth endoplasmic reticulum，SER)是细胞质中最常见的细胞器之一。当受精的精子触发卵母细胞内游离钙离子浓度升高，此时胚胎发育就开始了，这是因为储存在滑面内质网上的Ca2+反复释放和重新摄取的结果，Ca2+释放主要由卵母细胞的磷脂酰肌醇信号系统介导[4]。透射电镜观察发现，不成熟的卵母细胞中存在滑面内质网管和发育不全的滑面内质网聚集体，而成熟的卵母细胞中，数量最多的细胞器是线粒体-滑面内质网聚集体(mitochondria-SER，M-SER)。M-SER 聚集体直径从0.5～5 mm不等，被认为是细胞质成熟的标志[5-6]。M-SER聚集体是成熟卵母细胞受精过程中的触发因素，有助于产生典型的钙振荡；可能参与受精和第一次胚胎卵裂时的能量产生和储存[5-6]。

SERa 就是卵母细胞异常的一种。电镜检查发现畸形卵母细胞胞质内含有大量大的滑面内质网和线粒体簇，SERa 大小约为(25.3±6.6)～(26.4±6.4) μm[7-8]，在皮质下也观察到少数小的SERa，通常被线粒体包围，这些小的聚集体在倒置显微镜下看不到，但是电镜检查可以观察到[9]。超微结构发现大的SERa被异常形状的线粒体和由非常小的小泡组成的小致密小体所包围，内部有弯曲的致密小管，在外周较小的SERa中也观察到相同的病理改变。SERa MⅡ卵母细胞皮质和皮质下主要富含大空泡包裹SER和小SERa[8]，在未受精的卵母细胞、老化的卵母细胞和胚胎中也观察到。内质网(光滑或粗糙)在卵母细胞或胚胎的应激反应以及对减数分裂纺锤体的调节中起着关键作用[8]。线粒体ATP供应平衡是决定卵母细胞受精和胚胎发育能力的关键因素之一，在SERa卵母细胞中，存在非典型的钙释放模式，这种模式对正常的线粒体呼吸活动和线粒体ATP 的供应平衡产生有深远的影响。在分子水平研究结果提示在SERa 卵母细胞中，线粒体钙调节缺陷和能量ATP 动态平衡的紊乱可能会对下游胚胎发育产生负面影响[10-12]。通过采用基因芯片技术比较MⅡSERa 阳性和阴性卵母细胞基因表达谱，生物信息学分析表明，在SERa阳性的卵母细胞中，参与三个主要生物学过程的基因表达显著下调：(1)细胞分裂和有丝/减数分裂核分裂、纺锤体组装、染色体分离和有丝分裂细胞周期的G2/M 转变；(2)参与细胞骨架和微管组织形成；(3)线粒体的结构和活性；从而从分子水平强调SERa的存在与卵母细胞生理改变以及发育能力降低之间可能存在一定联系[10，12]。

2 SERa形成的原因

导致SERa卵母细胞的分子学机制和细胞活动仍不清楚，不同的因素可能参与了这种畸形的起源，并对临床结果有不同的影响。卵母细胞SERa的发生率为1.8%～23.1%[11，13-14]。有研究观察发现SERa 在常规IVF 周期和ICSI 周期中第二极体出现之后，原核出现之前消失，在常规IVF 周期存在时间为(6.16±1.06) h，在ICSI 周期存在时间为(5.43±1.9) h，在受精失败的卵母细胞内SERa 不会消失[15]。但是因使用显微镜的设备不同，胚胎学家的经验、知识水平以及对SERa的认知深度的不一致，导致SERa 报道的发生率也不尽相同。

2.1 SERa的形成可能与遗传有关一例28岁女性患者连续三个ICSI 周期中，共获得59 个均含有SERa MⅡ卵母细胞，三个周期ICSI 受精率分别为80%、50%和42%，但是经过移植以后均无正常新生儿出生[16]；有1例患者连续7个ICSI治疗周期，其中有6次出现SERa，移植后均未妊娠[8]，对于SERa阳性周期的患者，在后续再次发生SERa的比例甚至可以达到32%[17]。

2.2 SERa 的形成可能与促排卵激素药物的使用有关控制性超促排卵时，SERa 阳性周期患者需要更高剂量的促性腺激素(初始和总剂量)以及更长的刺激持续时间[7-8，14-15，18]。但是有些学者持以相反的观点，他们认为促性腺激素总剂量和刺激时间上并不导致SERa的形成[17，19-22]。在连续三个ICSI周期中促性腺激素的起始量都降低了，但是在后续的治疗周期中依旧获得全部SERa的卵母细胞[16]。也有报道，使用芳香化酶抑制剂促排的患者卵母细胞中SERa的发生率(15.2%)明显高于使用枸橼酸克罗米芬促排的患者(6%)[23]。

2.3 SERa的形成可能与体外培养时长有关SERa通常出现在MⅡ期的卵母细胞中，而不是在MⅠ和GV 期的卵母细胞中，并且在分裂中期延长时也会出现。将未受精的卵母细胞继续培养2～5 d 后，既往无SERa的卵母细胞中会出现SERa。在大SERa和/或小SERa之间可能存在连接，这些潜在的连接可能导致卵母细胞内部SERa进一步增大[11]。在继续培养过程中，老化卵母细胞可能会发生细胞质异常变化，大于35岁女性的卵母细胞对长期培养更为敏感[24]，SERa最有可能与该异常变化有关[9]。

2.4 SERa的形成可能与促排卵方案有关促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂或拮抗剂来抑制核成熟，GnRH 拮抗剂组SERa 发生率为(4.37±11.62)%，明显低于GnRH激动剂组的(7.36±17.17)%[25]。长方案所产生的SERa阳性周期明显多于SERa阴性周期[7]。刺激方案(例如拮抗剂方案、长方案、短方案等)和/或剂量的改变会降低产生优质成熟卵母细胞的可能性，说明刺激方案对卵母细胞SERa 产生有一定的影响[9]。然而有学者却持有相反的观点，短方案、长方案以及拮抗剂方案与SERa的产生并无因果关系[17]。

2.5 SERa的形成可能与性激素水平有关芳香化酶抑制剂促排的患者SERa阳性周期的血清雌二醇和孕酮水平均明显高于SERa阴性周期，枸橼酸克罗米芬促排的患者中SERa阳性和SERa阴性周期的血清雌二醇和孕酮无差别[23]。有研究提示血清雌二醇[7，9，15，20]和孕酮[15]浓度是显著变化的，但是有学者却指出与孕酮水平无显著相关[9，18，22，26]。基础状态下性激素水平在SERa阳性和SERa阴性周期中是无差别的，但是SERa阳性周期促排卵后血清雌二醇水平可升高[18，22，26]，显著高于SERa 阴性周期[(1 282.2±920.3) pg/mL vs (1 059.0±919.7) pg/mL][7]。单独使用卵泡刺激素的患者和卵泡刺激素与黄体生成素协同刺激的患者所获得的卵母细胞在结构和超微结构上存在明显差异[24]，黄体生成素过早激增可能导致MⅡ卵母细胞中SERa 的形成[11]。同时有研究表明，SERa阳性周期中卵母细胞获得数据比较多[13，19]。抗缪勒激素浓度较高的患者的SERa 发生率(6.4%)高于正常范围抗缪勒激素患者的SERa发生率(1.7%)[14]。

3 SERa对受精率以及胚胎发育的影响

SERa卵母细胞中观察到染色体排列紊乱和/或皮质肌动蛋白完整性丧失，导致细胞骨架异常，可能阻碍第二极体排除或导致受精后卵裂过程中的染色体分离错误和干扰细胞质分裂，这对胚胎存活率有明显的影响[10，12]，并且钙离子分布模式紊乱导致异常卵裂[11]。含SERa 的卵母细胞在第二极体排出过程中有丝分裂分裂失败的发生率和减数分裂失败的发生率均显著高于不含SERa 卵母细胞，ICSI 周期中减数分裂失败率更高，有丝分裂的过程中发生卵裂失败胚胎细胞可能变成四倍体，导致染色体构型异常，卵裂失败的细胞可能会发育滋养层细胞，导致胎盘形成障碍，SERa 卵母细胞来源的胚胎在形成内细胞团后，内细胞团在分裂的过程中也会发生卵裂失败，进而可能导致非整倍体发生[11]。

SERa 周期中，卵母细胞正常受精与SERa 直径呈正相关，单原核、三原核和未受精卵母细胞与SERa直径无关，胚胎继续培养后观察发现，第2天和第3天的胚胎形态不受SERa的影响[14]。SERa的存在能够显著降低受精率、胚胎卵裂率、囊胚形成率[20]以及优质胚胎形成率[8-11，14，18，22-23，27]。亚组分析(总MⅡ、正常MⅡ和SERa MⅡ)显示，SERa MⅡ的受精率受到严重影响，明显低于SERa 阴性卵母细胞，在继续行囊胚培养时发现，SERa 阳性的卵母细胞来源胚胎发育会受到限制，进入囊胚期的胚胎明显较少[8，14，21]，SERa导致内细胞团的质量下降35%[28]，囊胚形成率可由62.8%降为42.2%[13]，甚至为无囊胚形成[29]，但是在对形成囊胚进行评分时发现，SERa 的存在并不影响囊胚质量[14]。然而有研究确得出相反的结论，SER 阳性周期第2 天和第5 天更容易得到优质胚胎，囊胚形成率也略胜一筹[17]。也有一些研究证实，SERa 阳性周期的患者受精率、胚胎卵裂率、囊胚形成率以及优质胚胎形成率并无影响[7，13，15，19，21，23，25-26，30]。SERa 阳性周期中卵母细胞Veeck 分级越高，受精率和卵裂率却与SER 阴性周期越相近[9]。枸橼酸克罗米芬促排周期SERa 阳性和SERa阴性囊胚形成率却无差别[23]。在对亚组分析显示，在SERa阳性周期，SERa阳性MⅡ和SERa阴性MⅡ的受精率、IPN发生率、3PN发生率、以及在第3天和第5天发育成优质胚胎的能力相似[7，13，19，27]。当SERa 阳性MⅡ培养至第5/6天时，常规IVF和ICSI受精方式的不同对受精率、胚胎卵裂率和囊胚率也无影响[15]。

4 SERa对妊娠结局的影响

如果遵循2011 年Alpha/ESHRE 共识，将SERa 卵母细胞丢弃，可利用卵母细胞数量减少，部分患者无可利用胚胎，导致周期取消率增加，从而降低卵子数量有限的夫妇受孕的机会。周期取消率与血清卵泡刺激素水平和SERa 卵母细胞数呈显著正相关，在对获得卵子数进行分层分析发现，获得卵子数为1～5 个周期取消率最高[31]。

后代的表型在很大程度上取决于卵母细胞的质量，SERa 卵母细胞具有高非整倍体率(18%～37%)[28]。大SERa的出现表明细胞质是病理性的，胚胎发育、胚胎种植以及临床预后下降和新生儿畸形均与SERa有关，移植SERa阳性的卵母细胞来源的胚胎以后，种植率可降低40%[19]，妊娠率下降67%，生化妊娠率明显升高[9]，流产率增加20%[32]，但是抱婴回家率呈现一种相反的变化趋势[14]，即使是来自同一周期的SERa阴性的卵母细胞受孕机会也较低[9，19]，因此不建议SERa 的卵母细胞来源的胚胎用于移植[8]。

并非所有的研究都指出SERa的存在对妊娠结局不利。在玻璃化冷冻囊胚移植周期中，SERa阳性MⅡ在IVF和ICSI中的临床妊娠率没有显著差异，进一步Logistic 回归分析中，SERa 的存在与持续妊娠率之间没有显著关联(95%CI：0.505～1.963)[15]。在芳香化酶抑制剂和枸橼酸克罗米芬促排的患者SERa 阳性和SERa 阴性周期之间，在胚胎种植率、流产率以及活产率没有发现显著差异[23]。同时对于SERa 阳性周期的患者，无论是β-HCG 阳性的数量，还是临床妊娠率和流产率、种植率都没有显著减少[7，9，14，18-19，21，26，30]，但是随着含SERa 阳性卵母细胞比例的增加，活产率逐渐降低，含SERa 阳性卵母细胞比例大于50%时无活产胎儿出生[30]。在SERa 阳性周期中亚组分析显示，SERa阳性MⅡ卵母细胞妊娠率虽然低于SERa阴性MⅡ卵母细胞，但差异无统计学意义，流产率或活产率在两者之间无区别[7]。单纯SERa 阳性MⅡ卵母细胞来源胚胎移植(31例)、单纯SERa阴性MⅡ卵母细胞来源胚胎移植(235 例)和混合性胚胎移植(98 例)的妊娠率(25.8%、37.4% 和41.8%)、种植率(18.9%、17.4% 和13.1%)和临床妊娠率(22.6%、32.4%和37.9%)无明显差异[13]。但是也有研究指出SERa 卵母细胞形成的优质胚胎率明显降低[26]。SERa-MⅡ例数最少，但是异位妊娠率较高，却没有显著差异[8]。

5 SERa对新生儿结局的影响

有研究报道指出，SERa阳性周期中有386例新生儿出生，并详细记录这些新生儿情况，有364例健康新生儿，而22例孕妇发生了围产期并发症，这些并发症包括10例活产畸形，4例新生儿死亡，2例死产和6例终止妊娠；其中48例来自SERa阳性MⅡ卵母细胞来源胚胎移植，1例活产畸形，1例新生儿死亡，1例死产和1例终止妊娠；另有53例健康新生儿来源于混合移植，并伴有7例围产期并发症[33]。以上畸形主要表现为：膈疝、三体(47XY+21)综合征、重复肾、尿道下裂、心血管畸形、臂瘫以及Beckwith-Wiedemann 综合征等[8-9，13-14，16，33-34]。SERa阳性和阴性周期新生儿畸形率无区别[7，14-15，18，21，23，30]，但是随着含SERa 阳性卵母细胞比例的增加，活产率逐渐降低，含SERa 阳性卵母细胞比例大于50%时无活产胎儿出生[30]。SERa的患者妊娠期产科并发症比例相对较高，更容易出现早产，但是出生的新生儿体质量也明显降低[7，，14]，妊娠期较短[7]，但有研究却发现妊娠周数、新生儿体质量以及身长无差别[13，15，21]。

卵母细胞的安全性进行更多的流行病学研究，尤其有必要评估出生时和后期发育期间的畸形发生情况，SERa 作为预测临床结局的结论的研究样本量尚少，并且不同的研究结果之间存在一定的争议，SERa和胎儿畸形之间是否真的存在关联尚不清楚，但是也有可能存在失访漏报的可能性。

6 结语

2011年Alpha/ESHRE专家共识，强烈建议不要对受影响的卵母细胞进行授精，欧洲部分生殖中心调查结果显示，47.5%的生殖中心对SERa卵母细胞的管理政策接受Alpha/ESHRE 共识建议，然而只有大约13.8%的中心丢弃SERa 卵母细胞；42.5%的中心不会丢弃SERa卵母细胞，但会对移植SERa周期的胚胎和新生儿进行追踪随访；24.4%的中心在孕期会制定专门的妊娠监测。大约25%的中心会和患者沟通这种卵母细胞畸形，无论是丢弃还是移植，均应该获得患者知情并签署同书以后才能继续后续医疗行为[2]。鉴于目前研究有正常新生儿出生，特别是卵子数量有限的夫妇如若遵循该共识，会增加周期取消率，2017 年Alpha/ESHRE 再次提出专家共识，与患者充分沟通，正确地告知患者出生畸形的风险，以及不移植所导致妊娠机会降低，个体化处理[3]。

因此，本研究指出SERa 卵母细胞在辅助生殖技术中有一定的发生率。目前，对于该卵母细胞是否行体外受精意见尚不统一。就目前移植SERa卵母细胞来源的胚胎的研究数据而言，有健康新生儿出生，这些文献数据支持给予学者以及患者信心。临床上，丢弃SERa卵母细胞，可能是一种不合理的处理策略，应该让这些卵母细胞受精，继续发育成具有可利用价值的胚胎，避免了卵母细胞的浪费。再无其他适合移植的胚胎时，酌情考虑选择SERa卵母细胞来源的胚胎进行移植前。但应当充分告知患者，帮助其进行移植决策，且必须严格追踪胎儿情况以及密切随访观察新生儿的成长发育。对于卵母细胞SERa形成原因我们生殖工作者应该继续深入研究其机制，为临床避免SERa寻找一种治疗策略，改善不孕症患者的临床结局。