NK 细胞的生物学及其肿瘤免疫治疗研究进展

高紫玉，云升，邱英

(1.内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古 呼和浩特 010020；2.内蒙古医科大学附属医院肿瘤内科，内蒙古 呼和浩特 010020)

0 引言

自1975 年在鼠类和人类中发现NK 细胞以来，有证据支持它们在病毒感染和肿瘤免疫监测的早期控制中发挥关键的作用。一项为期11 年的随访研究所示，在人类中，NK 细胞毒性降低与癌症发病率增加相关[1]。NK 细胞对转移性或血液系统肿瘤表现出快速而有效的免疫力，目前正致力于在临床上充分利用NK 细胞的抗肿瘤特性。但实体肿瘤患者过继输注NK 细胞的结果却差强人意，其主要挑战之一是NK 细胞向肿瘤部位的运输和浸润。此外，肿瘤微环境中的抑制信号和肿瘤细胞免疫原性的改变也是肿瘤部位NK 细胞浸润和活化不良的原因。本文对NK 细胞的生物学及其在肿瘤中的最新研究进展进行概述，以期为后续研究及临床应用提供一些重要的参考依据。

1 NK 细胞的生物学

NK 细胞最初是在小鼠中鉴定的，研究人员注意到与T 和B 淋巴细胞截然不同的大颗粒亚型淋巴细胞，对小鼠肿瘤细胞系具有细胞毒活性[2]。从表型上看，NK 细胞表面缺乏B 和T细胞标记CD19 / TCR / CD3，但其表达CD16 和CD56 表面抗原。在外周循环中，大约90%的NK 细胞表达低水平的CD56，但具有高表达的CD16(CD16bright CD56dim)，这些细胞被认为是“成熟”的 NK 细胞，具有较高的细胞毒性。其余10%的NK 细胞为CD16dimCD56bright，被认为是“未成熟”的NK 细胞，通常存在于淋巴样组织中，对刺激反应更强，并分泌多种细胞因子[3]。NK 细胞的活化是通过激活受体和抑制受体之间的平衡来介导的，激活的NK 细胞通过刺激肿瘤细胞上的Fas 受体与NK 细胞上的Fas 配体相互作用，促使NK 细胞释放颗粒酶和穿孔素等进入肿瘤细胞，从而诱导caspase 级联反应，最终在肿瘤细胞中发生凋亡[4]。在NK 细胞受体中，NK 细胞激活的主要检查点是KIR 和NKG2A 抑制性受体，它们与自身HLA-I 类分子相互作用。目前已经在NK 细胞上发现了其他非HLA-I 类特异性抑制性受体，它们也影响了调节NK 细胞细胞毒性的最终平衡。这些受体包括T 细胞免疫球蛋白和ITIM 结构域(TIGIT)、PVR相关Ig 结构域(PVRIG)、淋巴细胞激活基因(LAG-3)、T 细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域包含-3(TIM-3)、程序性死亡-1(PD-1)和CD96[5]。这些非HLA-I 特异性的抑制性受体已成为NK 细胞活化的新免疫检查点。NK 细胞表达的激活受体协调其触发细胞毒性活性，包括NKG2D、NCRs(NKp46、NKp30 和NKp44)和DNAM-1，并被认为是NK 细胞与配体相互作用后对多种肿瘤进行活化的原因。

2 肿瘤微环境对NK 细胞的影响

癌症最初被认为是一种细胞和基因表达失调的疾病，现在也被认为是肿瘤微环境(TME)的疾病。TME 是在肿瘤侵袭周围组织的过程中产生的，它为肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞和细胞外基质提供了保护环境[6]。TME 会损害NK 细胞的表型，激活，持久性和功能。越来越多的数据表明，与非肿瘤组织中的NK 细胞相比，肿瘤组织中的NK 细胞显示出较差的细胞毒性能力，并伴有激活受体的下调和抑制受体的上调[7]。多项研究显示，多种实体瘤的生长会促进免疫抑制细胞(包括调节性T 细胞(Treg)，骨髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM))的扩增。另外，肿瘤细胞分泌趋化因子，如C-X-C 基序趋化因子配体8 或C-C 基序趋化因子配体2，以促进Tregs、MDSCs 或TAM 在肿瘤部位聚集。通过产生TGF-β 和IL-10，或通过细胞间直接的相互作用，这些免疫抑制细胞抑制瘤内NK 细胞的细胞毒作用[8-9]。MDSCs 通过膜结合型TGF-β 抑制NK 细胞的杀伤活性和细胞因子的分泌[10]。在肿瘤微环境的缺氧和炎症条件下，MDSCs 会释放高水平的腺苷。腺苷是一种重要的免疫抑制分子，通过限制IFN-γ/TNF-α 的释放，抑制Fas配体和穿孔素介导的细胞毒活性，阻断颗粒酶的胞吐而抑制NK 细胞的抗肿瘤活性[11]。肿瘤微环境中的肿瘤细胞，抗原呈递细胞，免疫抑制细胞和基质细胞上表达PD-L1 或PD-L2，通过结合活化NK 细胞表达的抑制受体，导致NK 细胞衰竭和功能障碍[12]。深入了解TME 及其作用和相关分子将为认识不同类型肿瘤的生物学行为提供重要的见解，这些数据将为开发以TME 为基础的治疗方法以治疗肿瘤提供必要的基础，TME 中的原癌过程和分子将成为新的癌症治疗的重要靶点。

3 基于NK 细胞的肿瘤免疫治疗策略

3.1 过继免疫治疗

NK 细胞过继免疫疗法的主要方法是未修饰的自体或异体NK 细胞的转移。自体NK 细胞移植治疗不同的血液系统恶性肿瘤和实体瘤是非常安全的，细胞的植入性和持久性较好，GvHD 的风险很低，但临床益处有限[13]。在血液学癌症患者自体造血干细胞移植(HSCT)后的早期观察到与大量循环抗肿瘤NK 细胞相关的积极临床结果[14]。相反，在转移性黑色素瘤、肾细胞癌或晚期胃肠道癌中，经扩增的自体NK 细胞的转移没有显示出积极的临床反应[15-16]。在许多情况下，循环自体NK 细胞在没有进一步的体外或体内刺激的情况下表现出弱的抗肿瘤细胞毒性。因此，近期进行的临床试验侧重于免疫治疗策略，即在化疗、细胞毒性T 细胞或单克隆抗体(mAbs)的联合环境下，用细胞因子(如IL-2/-15)或靶细胞(如K562-mb15-41BBL)激活自体NK 细胞，以达到其充分的抗肿瘤潜力。同种异体NK 细胞优于自体NK 细胞的原因在于，它不太可能被NK细胞介导的对自身MHC 分子的识别所抑制。从KIR 不匹配的供体过继转移单倍体NK 细胞已被证明是安全的，并且可以介导AML 患者完全缓解[17]。几项临床研究表明，异体输注NK细胞在不同的癌症环境(包括血液系统恶性肿瘤和实体瘤)中是安全有效的[18]。然而，目前关于NK 细胞过继转移在癌症治疗中有效证据仍然很少，许多都处于临床实验的第一期。在第1 期(NCT00402558)和第2 期(NCT01390402)临床试验中分析了异基因干细胞移植之前输注单倍体NK 细胞的效果，该试验招募了21 例高危AML，MDS 或CML 患者。HSCT 前的单倍性同种异体反应性NK 细胞输注耐受性好，不会干扰植入或影响GvHD 的发生率，五名患者表现出持久的完全缓解[19]。然而实体瘤的NK 细胞免疫治疗面临着NK 细胞向肿瘤微环境的浸润减少、肿瘤细胞对NK 细胞毒性缺乏敏感性、抑制性免疫细胞改变NK 细胞功能等挑战。将以NK 细胞为基础的免疫治疗与可以靶向免疫抑制的肿瘤微环境的方法相结合，可能会在实体肿瘤的治疗中提供好处。

3.2 CAR-NK 细胞

嵌合抗原受体(CAR)的T 细胞在血液学肿瘤中取得了巨大的成功，但在治疗实体瘤方面不是很理想。CAR-T 细胞疗法在临床治疗中也存在较多副作用，如细胞因子风暴、脱靶效应等。多项研究表明，CAR 修饰的NK 细胞可以克服CAR-T 细胞的上述缺点，并发挥显著的抗肿瘤作用[20-21]。CAR-NK 细胞疗法能靶向多种肿瘤抗原如神经节苷脂GD2、EGFR、CD244 受体、Wilms 肿瘤蛋白等，因此在治疗实体瘤方面取得了良好的临床效果。目前，脐带血衍生的CAR-NK 细胞(CD19-CD28-zeta-2A-iCasp9-IL-15 转导)正在针对复发/难治性CD19+B 淋巴恶性肿瘤进行临床试验(NCT03056339)。研究发现，在逆转录病毒转导的帮助下，NKG2D-DAP10-CD3ζCAR-NK 细胞中的NKG2D 表达增加，进而导致针对白血病和实体瘤细胞的细胞毒性增强，而且未观察到对健康细胞的细胞毒性增加[22]。在小鼠卵巢中衍生诱导的多能干细胞(iPSC)，通过CAR 修饰的NK 细胞增强了癌症模型的抗肿瘤活性[23]。而且，这种iPSC 衍生的CAR-NK 疗法已获批准用于临床，用于解决CAR-T 细胞存在的复发和高成本问题。

3.3 免疫检查点

近年来，免疫检查点抑制已成为免疫治疗领域最有希望的治疗之一。NK 细胞表达一系列抑制性受体，它们在浸润肿瘤的NK 细胞上被诱导或上调，并且与各自的配体相互作用时影响NK 细胞的抗肿瘤功能，甚至导致NK 细胞功能障碍或衰竭[24]。用单克隆抗体(mAb)对免疫检查点受体或配体的治疗性阻断可恢复NK 细胞的抗肿瘤功能。癌症患者浸润肿瘤的NK 细胞会诱导PD-1，从而导致活化的NK 细胞的功能衰竭，将导致预后不良。阻断PD-1 / PD-L1 信号显著增加了NK 细胞的细胞毒性和细胞因子产生，并显著抑制了体内肿瘤的生长[25]。针对CTLA-4 和PD-1 检查点途径的单克隆抗体(mAb)的使用已获批准用于临床，可在各种类型的癌症中产生持久的临床反应[26]。此外，两种途径的联合阻断具有更好的治疗益处，但可能产生的不良反应增多。

IPH2101、lirilumab(IPH2102)和 monalizumab(IPH2201)是针对KIR2DL1/2/3 和NKG2A 抑制受体的IgG4 单克隆抗体，并分别拮抗HLA-C 和HLA-E 介导的NK 细胞对肿瘤细胞的抑制作用[27-28]，IPH2101 阻断HLA-KIR 相互作用可增强NK 细胞的抗肿瘤活性，从而提高生存率，显示出对AML 细胞有效的临床前证据[29]。IPH2101 联合利妥昔单抗(抗CD20 单抗)可增加NK细胞介导的在体内外对小鼠淋巴瘤模型的杀伤作用[30]。在MM患者中输注IPH2101 可降低NK 细胞表面KIR2D 受体的表达和NK 细胞的反应性[31]。NKG2A/CD94 在NK 细胞和CD8+T细胞上均有表达，在子宫颈癌，乳腺癌，肝细胞癌和肺癌等实体瘤中，上调HLA-E 的表达，抑制NKG2A 表达，改善NK 细胞功能障碍。在异基因和自体造血干细胞移植中，NKG2A 在新生成的NK 细胞上均匀表达，使NKG2A 和HLA-E 相互作用成为治疗移植后NK 细胞功能的主要抑制因素之一[32-33]。IPH2201和西妥昔单抗(抗EGFR 单体)的联合应用显示，在以前治疗过的头颈部复发或转移性鳞癌患者中，客观缓解率为31%，没有严重的不良反应[34]。IPH2201 目前正在多种肿瘤类型的I/II 期临床试验中进行评估，综上所述，将抗KIR 或抗NKG2A 单克隆抗体与化学疗法或靶向肿瘤抗原或免疫检查点分子的其他单克隆抗体联合使用可能是实现临床疗效的一种有前途的策略。

TIM-3 是T 细胞介导的免疫反应的负调节剂。与T 细胞相比，NK 细胞基本表达TIM-3，并且在人PBMC 中TIM-3 的表达最高。TIM-3 在所有成熟的CD16bright CD56dim 细胞上表达，在IL-12、IL-15 和/或IL-18 刺激下进一步上调。此外，细胞因子激活可诱导未成熟CD16dim CD56bright NK 细胞表达TIM-3，因此TIM-3 可作为成熟和/或活化NK 细胞的标志物[35]。TIM-3在进展期胃癌(88 例)、肺腺癌(89 例)和进展期黑色素瘤(90 例)患者外周血NK 细胞中表达上调，在75%的胃肠道间质瘤(GIST)患者的肿瘤浸润性NK 细胞中也发现了这一点，有趣的是，GIST中TIM-3+肿瘤浸润的NK 细胞不共表达PD-1[36]。Tim-3 阻滞剂是对PD-1 阻滞剂有抵抗力的患者的新兴靶标，其中Tim-3的表达增加并被认为可以抑制肿瘤。这些研究表明，TIM-3 可作为预测癌症预后的生物标志物，是恢复NK 细胞抗癌活性的潜在治疗靶点。

4 小结

近十年中，癌症免疫治疗的成功发展代表了癌症治疗的一场革命。NK 细胞作为固有免疫中重要的效应细胞，具有强大的抗肿瘤功能。虽然NK 细胞在癌症的研究和治疗中还存在着很多挑战，比如NK 细胞的激活途径需进一步明确，某些药物产生耐药性以及机体自身易受损等，但从通过多种手段实现NK 细胞的过继移植到基因修饰的NK 细胞，再到现有的检查点抑制疗法，这些不断取得的成果让我们有理由相信，NK 细胞在肿瘤免疫治疗上的突破将不断更新，同时也会为越来越多的癌症患者带去希望。