METTL14在非小细胞肺癌中的表达以及预后意义

徐朝久 赵景胜 龙剑 丁文信 吴红花 梁静

肺癌目前是我国发病率、死亡率最高的恶性肿瘤，并且由于工业化、环境污染等因素加重，肺癌的发病风险逐年攀升，肺癌，已经成为不容忽视的公共卫生问题[1]。而非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常见的组织类型，早期难以诊断，多数患者确诊时已处于进展期，疗效预后较差[2]。6-甲基腺嘌呤(m6A)是高等真核生物最关键的一种RNA修饰，经甲基转移酶、组合蛋白及去甲基化酶调控后，能够参与细胞凋亡、分化以及机体发育过程[3]。据报道甲基转移酶METTL3在肺癌等多种癌症中出现异常表达，并且促进癌细胞增殖，抑制细胞凋亡[4]。而METTL3与METTL14均能表现出甲基转移酶活性，并且METTL14能表现出更高的酶活性[5]。目前鲜有关于METTL14与NSCLC之间联系的临床研究，因此我们本次研究将通过比较分析METTL14在NSCLC中的表达，探讨METTL14对于NSCLC的临床意义。

资料与方法

一、一般资料

选取2015年1月-2016年7月我院初诊收治并行手术切除术的NSCLC患者64例，收集术中切除的癌变组织(研究组)及相应的癌旁正常组织(对照组)。患者年龄(29～75)岁，中位年龄为64.50岁，其中男44例，女20例。其他临床资料(见表1)。纳入标准：1)所有患者均符合NSCLC诊断标准[6]，且术前6个月内未行放、化疗及相关治疗；2)组织标本均经病理科确诊，癌旁正常组织与病灶距离>5cm； 3)经超声及支气管镜等影像学检查，非处于妊娠期、哺乳期者或合并其他肺部疾病患者。排除标准：合并有其他系统恶性肿瘤及重要器官功能不全者。本次研究经我院医学伦理委员会批准，所获组织标本均经生理盐水清洗后，迅速分装储存于-80℃液氮中。

表1 NSCLC患者的一般临床资料[n(%)]

二、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测METTL14 mRNA表达

使用Trizol(美国INVITROGEN公司，15596018)提取组织中的总RNA，根据逆转录试剂盒(美国Thermo公司，K1622)说明书将RNA逆转录为cDNA。采用PCR仪(美国BIO-RAD公司，iCycler iC)对目的序列进行扩增，TransStart Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司，AQ101-01)行qRT-PCR，引物序列均由上海吉玛有限公司设计并合成(见表2)。反应体系：cDNA 2μL，正反向引物各0.4μL，2*TransStart Green qPCR SuperMix 10μL，使用Nuclease-free Water将反应体系补全至20μL。94℃预变性30s后采用两步法进行反应： 94℃变性5s，60℃退火/延伸30s，共42个循环。设置3复孔，采用2-△△Ct计算目的基因的相对表达量。

表2 引物序列

三、Western blot检测METTL14蛋白表达

使用RIPA(上海碧云天生物有限公司，P0013B)裂解并提取组织中的蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物有限公司，P0010S)检测蛋白浓度并配置蛋白样品，经SDS-PAGE电泳后将甲醇活化的PVDF膜与凝胶夹一起放置于转膜装置中，100V常规穿膜90 min。然后将PVDF膜用5%脱脂奶粉，37℃封闭1 h，随后分别加入METTL14、GAPDH抗体(美国abcam公司，ab220030、ab8245)稀释，4℃下孵育过夜。次日使用PBS洗涤三次，每次10 min，随后加入HRP标记的相应IgG二抗(美国abcam公司，ab205719)，37℃，孵育2 h，PBS洗涤三次，每次10 min，最后使用ECL发光试剂盒(上海碧云天生物有限公司，P0018)曝光显影，使用QuantityOne软件对扫描分析各条带吸光度。以GAPDH为内参，计算蛋白相对表达水平。

四、统计学方法

使用SPSS 21.0进行统计学分析，GraphPad 8绘制所需图片，计数数据以%表示,组间比较采用卡方检验。计量资料使用Mean±SD表示，组间比较使用配对t检验，采用Kaplan-Meier生存曲线绘制NSCLC患者生存情况，并采用Log-rank检验进行分析，采用多因素Cox回归分析影响患者预后的独立预后因素，当P<0.05为具有统计学差异。

结 果

一、METTL14 mRNA在NSCLC组织中的表达

qRT-PCR结果显示，METTL14 mRNA在研究组与对照组中的相对表达量分别为(3.03±1.02)、(1.01±0.04)，METTL14 mRNA在NSCLC癌变组织中的表达较癌旁正常组织高，具有统计学差异(t=15.629,P<0.001)(见图1)。

图1 METTL14 mRNA在NSCLC组织中的表达

二、METTL14 蛋白在NSCLC组织中的表达

western blot检测结果显示，METTL14 蛋白在研究组与对照组中的相对表达量分别为(0.21±0.05)、(0.13±0.03)，NSCLC癌变组织中的METTL14 蛋白表达较癌旁正常组织中高，差异具有统计学意义(t=8.874,P<0.001)(见图2)。

图2 METTL14 蛋白在NSCLC组织中的表达

三、METTL14表达与NSCLC患者临床病理特征之间的相关性

根据2.2中研究组METTL14蛋白表达的中位数0.21，将癌变组织分为METTL14高表达组、METTL14低表达组，每组32例，分析METTL14高、低表达与临床病理特征之间的相关性，结果发现TNM Ⅲ+Ⅳ级、合并淋巴转移的NSCLC患者METTL14高表达的比例较高，差异具有统计学意义(P<0.05)，METTL14高、低表达与患者的年龄、性别、病理类型以及吸烟史无关(P>0.05)(见表3)。

表3 METTL14表达与NSCLC患者临床病理特征之间的相关性[n(%)]

四、METTL14表达与NSCLC患者生存及预后之间的关系

对64例患者进行电话随访，平均随访时间为27.5(7～36)个月，METTL14高、低表达的NSCLC患者中位生存时间分别为23.5、34.5个月，总生存率分别为15.63%、46.88%，METTL14低表达的NSCLC患者预后优于METTL14高表达患者(χ2=5.226，P<0.05)(见图3)。随后使用Cox多因素回归模型分析NSCLC患者预后影响因素，结果发现METTL14高表达、TNM Ⅲ+Ⅳ级是影响NSCLC患者生存的独立预后因素(P均<0.05)(见表4)。

表4 Cox多因素回归模型分析NSCLC患者预后影响因素

图3 METTL14高、低表达NSCLC患者的生存曲线

讨 论

NSCLC(非小细胞肺癌)作为全球癌症死亡的主要原因，与其他癌症一样，其发生发展过程过程亦是涉及多种基因和途径改变的多阶段过程[8]。而m6A修饰是一种通过影响mRNA剪切、稳定、翻译等的RNA处理阶段而调控细胞分化的转录组标记，其水平升高可能会改变细胞正常的分化途径，导致细胞陷入祖细胞状态，与肺癌、胰腺癌等实体瘤的获得直接相关[9]。最近研究发现，m6A甲基化水平的降低，亦可以功能性抑制NSCLC细胞异常增殖和生长[10]，这为NSCLC的治疗提供潜在的治疗方向。

甲基转移酶是一种多样的大蛋白家族，其特点为一种存在S-腺苷甲硫氨酸特定结合结构域，目前已经被证明能够促使哺乳动物RNA发生甲基化[11]，其中METTL3负责m6A形成[9]，METTL14是mRNA结合和稳定所必需的的组成部分[10]，METTL3、METTL14能与Wilms肿瘤相关蛋白共同组成m6A[12]。并且METTL3与METTL14结合后的复合体可以诱导m6A在mRNA上沉积[11]。有趣的是，METTL3与METTL14必须保持在一个复合体中才能保持活跃[13]。Wang[14]等学者通过对METTL 3-14复合体的生化结构进行研究后发现，Mettl14为METTL3在其活性中心附近提供了结构上的支持，使METTL 3催化成为可能, METTL 3-14复合体的稳定存在对在RNA底物中高效生产m6A具有至关重要的作用。因此METTL14通过激活METTL3，使得METTL3-14复合体具有更强的增强催化活性[5]。

本次研究通过采用qRT-PCR、western blot检测METTL14在64对NSCLC癌变组织及癌旁正常组织中的表达，结果发现METTL14 mRNA与蛋白在NSCLC癌变组织中的表达较癌旁正常组织高，TNM Ⅲ+Ⅳ级、合并淋巴转移的NSCLC患者METTL14高表达的比例较高，METTL14高、低表达与患者的年龄、性别、病理类型以及吸烟史无关，这与之前的研究呈现一致性[15-16]。

此外，我们还分析了METTL14高、低表达与NSCLC患者预后生存之间的联系，结果发现METTL14低表达的NSCLC患者预后明显优于METTL14高表达患者。Cox回归模型分析发现METTL14高表达、TNM Ⅲ+Ⅳ级是影响NSCLC患者生存的独立预后因素。说明METTL14高表达可能与NSCLC的预后不良相关，可能作为NSCLC预后筛查的一个分子靶标，而Martin[17]等学者研究发现较高水平的METTL14，会导致编码m6A符合蛋白的基因改变，METTL14的缺失会诱导细胞生长抑制，细胞周期停止，诱导细胞凋亡和分化，这也从侧面辅证了我们的观点： METTL14高表达暗示不良预后。

综上所述，METTL14在NSCLC中过表达，METTL14可能参与了NSCLC的发生发展过程，与患者预后息息相关，为NSCLC预后的评估提供了参考依据，这有助于我们对于m6A在NSCLC中的理解，可能成为NSCLC潜在的治疗靶点。