血清中STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表达及炎症因子的变化在哮喘儿童中的诊断分析

褚保凤 底建辉 方强 张丽 马婷婷

哮喘是多种细胞及其组分参与的慢性非特异性炎症性疾病，多发病于儿童。威胁儿童健康的最常见的慢性哮喘的发病机制相当复杂，该病具体的发病机制还不明确[1]。气道炎症和气道重塑是该病的两个主要病理特征，过度的炎症因子表达与黏液分泌会导致气道阻塞，也会导致上皮杯状细胞增生/化生和黏膜下腺体增生肥大，从而在临床上表现为气道上皮纤维化、细胞外基质沉积等症状[2]。现代研究表明哮喘是一种免疫失衡性疾病，Th1/Th2平衡失调被认为是哮喘发病的关键机制，其中Th2释放IL-6、TNF-α等促炎症因子可致哮喘发病，IL-4、IL-13等抑炎症因子可以促使B细胞合成IgE，拮抗Th2细胞反应，抑制哮喘发病[3-4]。信号转导子和转录激活子(signal transducers and activators of transcription，STAT)是一类能与靶基因调控区结合的胞浆蛋白家族，其与酪氨酸磷酸化信号偶联，发挥转录调控作用[5]；当前研究显示STAT6在肺组织中的表达显著高于其他器官，其能调控许多不同的生理过程，比如炎症因子释放、应激反应、转录沉默、染色质稳定性、细胞周期、凋亡、自噬、生长抑制等[6]。半乳糖凝集素(Galectin)家族在炎症反应、免疫调节中也起重要作用，特别是在哮喘的发病中也起着不可或缺的作用，Galectin-9在哮喘患者的血浆及肺泡灌洗液中表达显著增加[7]，但是与哮喘相关因子关系的方面还无相应的研究。胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一种与IL-7类似的细胞因子，其作为气道炎症的上游调控因子，在哮喘发病中起着中心调控作用[8]。miRNA指长度约为22nt的特殊小型非编码RNA，可抑制促进靶mRNA降解和/或mRNA翻译过程，从而发挥对靶基因的负反馈调节作用[3]。miR-31在哮喘中呈现异常表达情况，也可参与哮喘的发生与发展过程。本文具体探讨与分析了血清中STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表达及炎症因子的变化在哮喘儿童中的诊断价值，以阐明哮喘的发生机制，为早期诊断哮喘与预测预后提供参考，现总结报道如下。

资料与方法

一、研究对象

本研究得到了医院伦理委员会的批准，采用总结性研究方法，研究时间为2016年2月到2018年1月，选择在北京市大兴区人民医院诊治的哮喘患儿72例作为观察组，纳入标准：足月分娩，年龄在1～6岁的儿童；符合哮喘的诊断标准,处于哮喘缓解期患者；患儿家属对本次研究具有知情权，且均自愿签署知情同意书。排除标准：心力衰竭、呼吸衰竭等严重并发症患儿；特应性体质史及家族特异性疾病史患儿；免疫功能低下、21-三体综合征综合征，严重佝偻病等患儿；低出生体重儿、慢性肺疾病、先天性气道畸形患儿。

同期选择健康儿童72例作为对照组，纳入标准：近2周未患呼吸道感染的的健康体检儿童，既往无哮喘史；无个人和家族特应性病史。

两组患儿的资料对比，差异无统计学意义(P>0.05)。观察组患儿平均病程3.10±1.40个月；发病程度：轻度32例，中度28例，重度12例(见表1)。

表1 两组患儿的一般情况对照

二、指标检测方法

检测治疗前1周及治疗1个月时血清STAT-6、Galectin-9、TSLP指标，抽取两组小儿的空腹静脉血2～3 mL，静置1 h后4℃ 3 000 r/min离心10 min(离心半径为15 cm)，取上层血清，保存于-80℃冰箱。

采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法批量测定TNF-ɑ、IL-6等炎症因子含量，检测试剂盒购自上海生工公司。也采用ELISA法方法检测STAT-6、Galectin-9、TSLP含量，STAT-6试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，Galectin-9试剂盒德国购自Laboratorien GmbH公司，TSLP试剂盒购自美国Biocheck公司。

检测治疗前1周及治疗1个月时全血miR-31指标，取1.2中的血液样本，EDTA抗凝后1 h内2 000 rpm/min离心10 min，取下层全血组织，用无RNA酶的EP管进行分装，长期冻存于-70℃超低温冰箱。按照美国Ambion公司的RNA提取试剂盒提取血浆的总RNA，采用qRT-PCR技术(7500 Fast Real-time PCR 仪，美国ABI公司)检测全血中miR-31表达水平，以U2为内参。miR-31表达水平采用2-ΔΔCt计算。反应条件为95℃ 10 min，(95℃ 15s，60℃ 1 min)×40个循环，并设置3个平行复孔及阴性对照。

三、临床资料调查

采用自行设计的统一问卷调查表，由专业人员对所有小儿家长采取问卷调查，调查内容包括小儿的性别、姓名、年龄、身高、潜在疾病史、既往病史、个人特应性体质史、特应性家族史。还包括观察组患儿的病程、病情等，行常规哮喘检测治疗前1周及治疗1个月的肺功能指标FEV1%和PEF%检测。

四、统计方法

使用SPSS for Windows 20.00软件包对本研究的所有计数、计量资料进行数据学分析，计数资料采用百分比表示，组间对比采用卡方检验，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，关性分析采用Pearson相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、炎症因子及STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31含量对比

观察组血清TNF-ɑ、IL-6等炎症因子含量显著高于对照组(P<0.05)。观察组血清STAT-6、Galectin-9、TSLP1等含量显著高于对照组(P<0.05)。观察组的全血miR-31相对表达水平显著高于对照组(P<0.05)(见表2)。

表2 两组血清TNF-ɑ、IL-6等炎症因和含量对比(pg/ml，均数±标准差)

二、治疗前后肺功能指标及症因子及STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表达

治疗后肺功能指标FEV1%和PEF%均高于治疗前，炎症因子及STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表达均低于治疗前(P<0.05)(见表3)。

表3 治疗前后肺功能指标及症因子及STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表达

三、相关性分析

在观察组患儿中，Pearson相关性分析显示血清TNF-ɑ、IL-6、Galectin-9、STAT-6、TSLP 、STAT-6、TSLP、miR-31含量与肺功能指标呈显著负相关性，与病情等级成正相关(P<0.05)，与年龄无相关性(见表4)。

表4 哮喘儿童血清炎症因子、STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31与肺功能的相关性(n=72)

四、ROC曲线分析

ROC曲线显示炎症因子TNF-α、IL-6的曲线下面积为0.922，0.947； STAT-6、Galectin-9、TSLP曲线下面积分别为0.918，0.927，0.936；miR-31曲线下面积为0.937，炎症因子和STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31检测儿童哮喘具很高的判断价值。

讨 论

哮喘是一种慢性反复发作性疾病，是一种以肥大细胞、T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润为主，伴有巨噬细胞、淋巴细胞等参与调节的气道慢性炎症性疾病。现代研究表明气道炎症，气道高反应性及气流受限是哮喘的三大特征，其中气道炎症是该病的病理基础，炎症因子的过量释放在哮喘发生、发展过程中起主要作用[9]。IL-6是在机体内的淋巴和非淋巴组织细胞中产生的，IL-6可参加炎症介质的级联反应；TNF-ɑ被认为是引起哮喘的最重要细胞因子之一，TNF-ɑ可促进形成逐级放大的瀑布样链锁反应，诱导组织细胞损害[10-11]。本研究显示观察组血清TNF-ɑ、IL-6等炎症因子含量显著高于对照组(P<0.05)，表明哮喘伴随有炎症因子大量释放状态。

当前已有证据显示信号通路是细胞间、细胞与细胞外基质一个重要的信息传递工具，参与机体的生理和病理过程。STAT6是STAT家族成员之一，STAT6传导通路的异常与多种过敏性疾病密切相关[12]。STAT6基因转录产物可产生三种结构蛋白-STAT6a、STAT6b和STAT6c，STAT6通过JAK/STAT信号转导途径转导细胞因子诱导的基因表达，促进B细胞分化和IgE的类型转换，从而介导哮喘的气道炎症和气道高反应性。Galectin-9含有11个外显子，编码蛋白约为36 kDa，其在组织中分布十分广泛，多分布在胰岛细胞、肺脏、免疫细胞、肝脏、扁桃体中。Galectin-9能诱导嗜酸性粒细胞聚集和活化，在细胞黏附、凋亡、分化、炎症反应的调控中发挥着重要作用。外源性IFN-Υ刺激人脐静脉内皮细胞产生Galectin-9[13]。TSLP是一种新型的主要由上皮细胞分泌、与IL-7类似的Ⅰ型细胞因子，主要表达于胸腺、气道、肠道、扁桃体、胸腺细胞中。致敏原以及病原微生物可诱导机体内大量表达TSLP，促进初始T细胞向效应T细胞转变，从而启动哮喘、支气管炎和皮肤过敏的炎症反应。本研究显示观察组血清STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31等含量显著高于对照组，提示上述因子在哮喘病程中发挥重要作用。当前也有研究表明TAT6敲除小鼠接缺乏典型的Th2相关趋化因子反应，STAT6可通过上调IgE血清水平而促进哮喘的发生[14]。Galectin-8通过与CD44的结合促进ICAM-I的分泌，从而与哮喘炎症及气道重塑。TSLP可以进一步启动CD4+T细胞前体分化为Th2细胞，产生经典的Th2炎症细胞因子，后者可进一步参与免疫级联放大反应，从而参与哮喘气道炎症反应和气道黏液高分泌发生。

图1 不同因子的ROC曲线

哮喘具有一定的遗传倾向，也是一种免疫失衡性疾病，已发现超过100个哮喘易感基因位点。而通过阻断炎症因子细胞生成、抑制其活化，减轻Th2介导的气道炎症，有望成为哮喘治疗的新策略。本研究Pearson相关性分析显示，观察组患儿的血清TNF-ɑ、IL-6、STAT-6、Galectin-9、TSLP及全血miR-31指标与肺功能指标呈显著负相关与病情等级正相关，提示这些指标能影响哮喘的病情。STAT6是介导过敏性炎性反应的重要因子，通常由Th2相关细胞因子如IL-6、TNF-α激活并诱导初始T细胞分化为Th2细胞以后，与哮喘易感性之间存在关联[15]。最新研究表明STAT6是决定Thl型细胞因子作用的关键信号通路，IL-6、TNF-α刺激T细胞后，出现STAT6的活化[16-17]。Galectin-9具有特征性的氨基酸序列，由大约130个氨基酸序列组成高度保守的糖识别结构域；该因子可引起白细胞系的粘附，并对T细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、B细胞、中性粒细胞表现出重要的粘附活性；并且Galectin-9可促使整合素介导的酪氨酸磷酸化，使ERK1/2活性增高，释放过氧化物，促进哮喘发作，进一步促使气道重塑[18]。TSLP可激活未成熟的DC细胞，促进产生细胞因子IL-6、TNF-α等，能够吸引嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞聚集Th2细胞，从而启动过敏性炎症[19-20]。miRNA是一类高度保守、长度很短的非编码调控单链RNA，可在转录后水平，通过抑制靶基因mRNA翻译或诱导靶基因mRNA降解，来调控靶基因的表达。miRNA可参与生命过程中一系列重要的进程，包括早期胚胎发育、肿瘤发生发展和侵袭转移、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢等。miR-31可作为肺癌、胃癌的诊断和预后靶标，并且其表达谱，在哮喘患者和正常人中不同，可作为诊断包括哮喘在内的多种疾病的标志物[21-22]。ROC分析显示炎症因子和STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31指标在哮喘的诊断中具有很高的判断价值。不过本研究也有一定的不足，研究对象的入选存在一定的偏倚，不能排除个别对象存在高反应性，且研究的指标也相对较少，相关性分析还需要明确，将在下一步进行深入分析。

总之，哮喘患儿表现为血清STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31含量显著升高，并伴随有炎症因子TNF-ɑ、IL-6的释放，与哮喘病情存在正相关性，可影响哮喘的发生。