硼替佐米通过PPARγ途径抑制肺动脉平滑肌细胞TRPC蛋白的表达

田国英 徐磊

肺动脉高压(Pulmonary hypertension，PH)是一类严重危害人类健康的疾病，可导致肺血管阻力和肺动脉压力的进行性升高，从而发展为右心室肥厚，心力衰竭甚至死亡[1]。在过去几十年间，虽然前列环素、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂等靶向药物的发现[2-3]推动了PH患者的临床治疗，但这些药物疗效有限，价格昂贵，而且只能延迟病程进展或缓解症状，无法有效延长患者的长期生存时间、降低疾病的死亡率[3]。此外儿童患者也给家庭带来打击和负担[4]。因此研发新型的有效、适用、经济的肺动脉高压治疗药物具有十分重要的意义。近年来，有研究表明蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib，BTZ)对肺动脉高压模型动物有较好的治疗作用，但是其机制并不十分清楚。前期研究发现硼替佐米影响钙池操纵性钙内流(store-operated Ca2+entry, SOCE)是其治疗肺动脉高压的可能分子机制[5]。本研究将研究硼替佐米对肺动脉平滑肌细胞钙池操纵性钙通道(store-operated Ca2+channel，SOCC)组成蛋白TRPC1、6表达的影响并探讨其分子机制。

资料与方法

一、主要试剂和仪器

倒置相差显微镜，为德国Leica公司产品。体式显微镜来自重庆奥特光学仪器有限责任公司。二氧化碳培养箱、三气培养箱购自美国Thermo公司。硼替佐米、T0070907购自美国MCE公司。Cy3标记二抗购自美国Jackson公司。TRPC1、TRPC6、PPARγ兔源性多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，β-actin小鼠源性单克隆抗体购自美国sigma公司。HRP标记的羊抗兔及羊抗鼠二抗，均购于博士德公司。Ⅰ型胶原酶、木瓜酶、DTT购自美国Sigma公司。DMEM低糖培养基、胎牛血清购自美国GIBCO公司。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris碱、过硫酸铵、十二烷基硫酸钠、甘氨酸、聚偏二氟乙烯膜、ECL化学发光液、蛋白电泳转移系统均为美国Bio-rad公司产品；RIPA细胞裂解液购于中国碧云天生物技术公司；其余试剂均为国产分析纯产品，购于广州试剂公司。

二、实验方法

1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠10只，体质量200～250 g，由内蒙古医科大学实验动物中心提供，自由饮食。

2 原代培养远端肺动脉平滑肌细胞 大鼠处死前称体质量，用3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉，迅速取下心肺组织，置于预冷的有钙HBSS溶液中，取出后，背侧朝下固定心肺组织，加入适量有钙HBSS液保持组织湿润，于体视镜下用显微外科剪去除血管旁结缔组织分离出肺动脉，用细胞刷轻轻刷除血管内壁的内皮细胞，获得大鼠远端肺动脉平滑肌组织。将分离好的血管平滑肌层放入消化酶内，置于37℃水浴箱内消化约18～20 min，加入1 mL含10% FBS的培养基中止消化，1000 r/min离心3 min，小心吸弃上清液，加入2～3 mL的含10% FBS的DMEM低糖培养基，用1 mL枪头小心吹打10～15次左右，使细胞悬浮。将细胞悬液接种于35 mm细胞培养皿中，需要鉴定的细胞接种于放置有圆形盖玻片的35 mm培养皿中，37℃细胞贴壁15～20 min，再补加适量培养基，37℃、5%CO2恒温培养[6]。

3 细胞处理 待细胞融合度达到70%～80%时，将培养基换为含0.5% FBS的DMEM低糖培养基后再培养24 h。将细胞分为常氧组、常氧+BTZ组、低氧组、低氧+BTZ组。常氧组及常氧+BTZ组置于37℃、5%CO2培养箱恒温培养。低氧组及低氧+BTZ组置于37℃、5%CO2、3%O2培养60 h。常氧+BTZ及缺氧+BTZ组在培养基内加入BTZ，使终浓度为10nM。另一批细胞，分为低氧组、低氧+BTZ组、低氧+BTZ+T0070907组，前两组处理同前，低氧+BTZ+T0070907组在培养基内加入BTZ，终浓度为10nM；加入T0070907，终浓度为5nM。

4 TRPC1、TRPC6及PPARγ蛋白检测 按文献[7-8]使用蛋白免疫印迹法进行检测，培养后的细胞，迅速用预冷PBS洗涤3次，每皿加RIPA裂解液50 μL，用细胞刷充分刮擦细胞，然后将标本转移至1.5 mL EP管，置于冰上；摇床上冰上继续裂解30 min；4℃离心机12 000 rpm，离心30 min；测定蛋白浓度。各组蛋白按40 μg上样，用12%SDS-PAGE电泳分离蛋白，浓缩胶120 V，10 min，分离胶150 V，60 min；电转法冰上转膜，5%milk-TBST封闭1 h，一抗过夜，第二天用含0.1% tween 20的TBST洗膜3～5次后附二抗，常温摇床孵育1 h后再用含0.1% tween 20的TBST洗膜3～5次，然后ECL发光液显影并X线胶片曝光。

结 果

1 硼替佐米对大鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC1蛋白表达的影响 Western blot结果表明(见图1A、C)，低氧组大鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC1蛋白相对常氧组的表达量为(158±11)%(P<0.01)，有统计学差异。低氧+BTZ组大鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC1蛋白的表达为常氧组的(112±8)%，与低氧组相比，低氧+BTZ组大鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC1蛋白的表达显著降低(P<0.05)。

2 硼替佐米对大鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC6蛋白表达的影响 Western blot结果表明(见图1 A、D)，低氧组大鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC6蛋白相对常氧组的表达量为(146±9)%(P<0.01)，有显著统计学差异。低氧+BTZ组大鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC6蛋白的表达为常氧组的(107±6)%，与低氧组相比，低氧+BTZ组大鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC6蛋白的表达显著降低(P<0.05)。

3 硼替佐米对大鼠肺动脉平滑肌细胞PPARγ蛋白表达的影响 Western blot结果表明(见图1 A、B)，低氧组大鼠肺动脉平滑肌细胞PPARγ蛋白相对常氧组的表达量为(65±7)%(P<0.01)，有统计学差异。低氧+BTZ组大鼠肺动脉平滑肌细胞PPARγ蛋白的表达为常氧组的(98±6)%，与低氧组相比，低氧+BTZ组大鼠肺动脉平滑肌细胞PPARγ蛋白的表达显著升高(P<0.05)。

图1 硼替佐米对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的TRPC1、TRPC6及PPARγ蛋白表达的影响

4 PPARγ抑制剂T0070907对硼替佐米介导的大鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC蛋白表达的影响 Western blot结果表明(见图2)，低氧+BTZ组大鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC1蛋白相对低氧组的表达量为(65±7)%(P<0.01)，有显著统计学差异。低氧+BTZ+T0070907组与低氧+BTZ组相比，TRPC1蛋白的表达显著升高(P<0.05); 低氧+BTZ组大鼠肺动脉平滑肌细胞TRPC6蛋白相对低氧组的表达量为(71±5)%(P<0.01)，有著统计学差异。低氧+BTZ+T0070907组与低氧+BTZ组相比，TRPC6蛋白的表达显著升高(P<0.05)。

图2 PPARγ抑制剂T0070907对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的TRPC1、TRPC6蛋白表达的影响

讨 论

肺动脉高压患病率约为全球人口的1%，65岁以上人群PH的患病率高达10%[9]。我们目前还没有准确的关于PH发病率的数据，中华慈善总会估算我国约有1200万肺动脉高压患者。因此，肺动脉高压已经成为严重危害人民群众健康的一大类疾病。在过去十年间，虽然前列环素、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂等靶向药物的发现[2-3]推动了PH患者的临床治疗，但这些药物疗效有限，价格昂贵[3]。肺动脉高压的死亡率仍然继续增长，在女性患者每年增加2.5%，在男性患者每年增加0.9%[4]。因此研发新型的有效、适用、经济的肺动脉高压治疗药物具有十分重要的意义。

硼替佐米是水溶性丙氨基酸硼酸衍生物，是第一个应用于临床的蛋白酶体抑制剂，已用于治疗多发性骨髓瘤、淋巴瘤、急性白血病、慢性粒细胞白血病和骨髓增生异常综合征等[10-11]。近年来，有研究表明硼替佐米对肺动脉高压模型动物有较好的治疗作用[5,12-13]。其机制可能与影响平滑肌细胞一氧化氮信号通路和保护内皮等有关[14-15]，但其机制仍然有待进一步深入研究。张军及我们前期研究者发现硼替佐米可以通过抑制低氧介导的肺动脉平滑肌细胞钙稳态失衡从而抑制肺血管异常收缩和重塑，对肺动脉高压起到治疗作用。其具体的分子机制与硼替佐米可以抑制SOCC通道组成蛋白TRPC1、TRPC6及Orai1的表达有关[5,16]。本研究也验证了硼替佐米可以抑制低氧介导的肺动脉平滑肌细胞TRPC1、6表达的上调。但硼替佐米是通过什么机制影响TRPC的表达有待进一步的研究。

近年来的研究发现，PPARγ配体激活 PPARγ 后，具有抗肥胖、高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤等疾病的有益作用，使得围绕PPARγ 受体功能和配体筛选研究成为生物医学和药理学研究的前沿热点，成为治疗上述顽疾的新的药物靶标。PPARγ活化后能够抑制多种炎症介质和细胞因子分泌，调节巨噬细胞活性，抑制炎症细胞、平滑肌细胞、内皮细胞增殖迁移，具有抗炎、抗增殖、促凋亡的特性，并增强糖皮质激素的靶细胞效应，减轻气道炎症，防止气道重构[15]，肺动脉高压大鼠及特发性肺动脉高压患者,肺内及血管上PPARγ表达减少[10]。

过氧化物酶体活性增殖物受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARγ)与肺动脉高压的关系研究近年来引起研究者的重视[17]，血管上皮组织特异性敲除PPARγ小鼠,会自发肺动脉高压伴随右心室肥大和远端小肺动脉肌化。而靶向平滑肌PPARγ敲除的小鼠也会导致自发肺动脉高压[18]。Wang等[19]发现PPARγ在大鼠肺动脉平滑肌细胞中可能通过抑制钙池操作性钙通道(SOCC)及TRPC表达发挥抗增殖、抗迁移、促凋亡的作用，而这些作用在缺氧或低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor，Hif)1α累积的情况下被抑制。PPARγ可能通过抑制HIF-1α的表达及其信号转导靶向调节SOCE和TRPC的表达，最终减缓慢性缺氧肺动脉高压。本研究发现硼替佐米可以抑制低氧介导的PPARγ表达的下调，提示硼替佐米可能是通过影响PPARγ参与TRPC表达的调节。

因此本研究应用PPARγ特异性抑制剂T0070907刺激原代培养的肺动脉平滑肌细胞，发现硼替佐米对低氧介导的TRPC1、TRPC6蛋白表达上调的抑制作用被抵消，说明硼替佐米可能是通过PPARγ参与TRPC表达的调节。这为阐明硼替佐米治疗肺动脉高压的分子机制提供新的理论解释：硼替佐米可能是通过PPARγ-TRPC-SOCE信号通路抑制低氧引起的肺动脉平滑肌细胞内钙稳态失衡，从而达到治疗肺动脉高压的作用。但硼替佐米对TRPC1、TRPC6表达的抑制作用是否只通过影响PPARγ起作用，还是与其发挥蛋白酶体抑制剂作用相关？另外硼替佐米影响PPARγ蛋白的表达的分子机制，还有待进一步研究。综上所述，本研究发现硼替佐米可以通过调控PPARγ表达参与低氧引起的肺动脉平滑肌细胞TRPC1、6蛋白表达的调节，从而揭示了硼替佐米治疗肺动脉高压的部分分子机制。