产ESBLs大肠埃希菌检出率、基因型分布及其耐药性分析*

周鹰豪 蔡志军 刘军

β-内酰胺酶环对单环内酰胺类、头孢菌素类、青霉素类等多种抗菌药物具有抗菌活性结构，可损伤细菌胞壁，使其裂解，应用广泛[1-2]。但β 内酰胺酶可对β 内酰胺类抗生素的β 内酰胺环水解，使抗生素结合细菌细胞内膜上的靶位点改变，或难以与细菌靶位结合，使抗菌活性消失或降低，而细菌产生耐药的重要机制为产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）[3-4]。目前临床使用抗生素多为经验性用药，但因不同基因型ESBLs对抗菌药物水解特性不同，增加治疗难度，影响抗菌治疗效果。大肠埃希菌是产ESBLs的主要菌种，随着抗菌药物广泛、大量使用，其耐药现象日益严重。为此，本研究旨在分析产ESBLs大肠埃希菌检出率、基因型分布及其耐药性，为指导临床合理选择抗菌药物提供指导。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2018年1月-2020年1月医院细菌室经患者血液、伤口分泌物、痰液中分离出的大肠埃希菌82株。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 美国BD公司的phoenix-100的确证药敏纸片和MH培养基，美国BD公司的phoenix-100全自动细菌鉴定药敏分析仪；分别购自宝生物工程（大连）有限公司、上海博尚生物技术有限公司、美国应用生物系统公司的聚合酶链反应（PCR）反应体系、反应引物、扩增仪。

1.2.2 产ESBLs表型确证实验 采用美国临床实验室标准化研究所（CLSI）推荐的双纸片协同试验法检测产ESBLs表型，将0.5麦氏单位菌悬液均匀涂抹于MH琼脂平板，并分别贴上头孢噻肟/克拉维酸药敏纸片（30/10 μg）、头孢噻肟药敏纸片（30 μg）、头孢他啶药敏纸片（30 μg）、头孢他啶/克拉维酸药敏纸片（30/10 μg），35 ℃下孵育17 h，测量抑菌圈，抑菌圈直径减去不含克拉维酸药敏纸片所产生的抑菌圈直径≥5 mm，则结果评定为产ESBLs阳性菌株。

1.2.3 PCR反应 将纯培养大肠埃希菌置入0.5 mL的离心管内（内预置200 ng/mL蛋白K溶液200 μL），95 ℃水浴10 min，15 000 r/min离心操作30 s，离心半径为6 cm，取上清液作为基因检测的模板液。PCR反应体系组成：10倍PCR扩增缓冲液5 μL、上游引物1 μL、dNTP混合物4 μL、模板液2 μL、无菌去离子水36.75 μL、下游引物1 μL、premix Taq DNA聚合酶0.25 μL。反映程序：分别行94 ℃预变性2 min与变性30 s，30 s的49～53 ℃退火，72 ℃退火1 min，32个循环，72 ℃延伸10 min 。PCR序列、反应引物见表1。

表1 PCR序列、反应引物

1.2.4 细菌鉴定及药敏试验 严格参照《全国临床检验操作规程》进行细菌鉴定操作[5]，将标本接种麦康凯平板和哥伦比亚血琼脂平板，四区划线，置入CO2培养箱中孵育16～18 h，温度为37 ℃，对各个培养基上细菌菌落特征进行观察，挑选单个菌落实施革兰染色，选取革兰阴性杆菌用Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪及其配套试剂进行细菌鉴定及药敏试验。将生理盐水3 mL加入比浊管中，在比浊仪上实施空白对照，浊度归零。从培养皿上用无菌一次性拭子挑取菌落，置入比浊管中不断研磨混匀，将菌悬液浓度调节至浊度0.50～0.63麦氏单位。在样品架上间隔放置仅装有3 mL生理盐水的比浊管和含菌悬液比浊管，用移液器从含菌悬液比浊管中吸取菌悬液145 μL，加入相邻的生理盐水比浊管中，反复吹打均匀。从冰箱中取出革兰阳性杆菌鉴定卡和药敏卡，放置于室温下约2 min，分别置入对应比浊管，确保卡片上输样管充分陷入至菌悬液中。置入全自动微生物分析仪的加样舱，舱门关上，点击START FILL充分吸样约70 s。将标本取出，放入孵育舱孵育18～24 h。将电脑软件主页面打开，对卡面信息核对，依次输入菌株样本号子相应表格、保存。在电脑Lis系统中输入分泌仪鉴定分析的生化药敏结果，根据细菌在不同浓液药物中生长情况判读耐药和敏感情况。

1.3 观察指标 分析产ESBLs大肠埃希菌检出率、耐药性、基因型分布情况。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 产ESBLs大肠埃希菌检出率与基因型分布情况 82株大肠埃希菌中产ESBLs大肠埃希菌检出率为53.66%（44/82），其中43株（97.73%）为BlaCTX-M基因型，其中以BlaCTX-M-9为主，其余1株携带BlaTEM基因型，经测序对比，菌株为BlaTEM-1型。见表2。

表2 BlaCTX-M基因型分布情况

2.2 产ESBLs大肠埃希菌主要基因分型耐药性分析 BlaCTX-M-9、BlaCTX-M-1对头孢曲松、头孢噻肟、头孢唑林耐药率为100%，对亚胺培南的耐药率为0，对左氧氟沙星耐药率90%以上。BlaCTX-M-1对头孢吡肟、氨曲南、头孢他啶耐药率高于BlaCTX-M-9，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 产ESBLs大肠埃希菌主要基因分型耐药性分析 株（%）

3 讨论

大肠埃希菌是广泛存在于自然界中的重要条件致病菌，当机体菌群失调、免疫抑制变弱或寄居部位改变时，其能导致肠道外感染，导致患者出现多个器官、部位的感染[6-8]。大肠埃希菌感染可从血液、尿液、分泌物、痰液、腹水等多种临床标本中分离到，可见于临床各个科室，其主要致病物质为黏附素、定居因子、内毒素、外毒素等。大肠埃希菌具有复杂的耐药机制，其主要耐药机制为ESBLs[9-10]。ESBLs是主要产生于革兰阴性杆菌的水解酶类，可对绝大部分氧亚氨基头孢菌素类和β-内酰胺类抗菌药物水解，进而对该类药物产生耐药。ESBLs基因种类多样，不同基因型酶耐药谱和不同地区、不同医院流行的ESBLs基因型均存在一定差异。本研究结果显示，82株大肠埃希菌中产ESBLs大肠埃希菌检出率为53.66%（44/82）。BlaCTX-M基因型分布最高，BlaCTX-M-9为主，其次为BlaCTX-M-1，提示大肠埃希菌产ESBLs携带率较高，BlaCTX-M为最常见分型，并以BlaCTX-M-9型为主，与杨宏斌等[11]研究存在一定差异。不同地区、医院大肠埃希菌产ESBLs携带率存在一定差异，这与不同医院对感染控制力度差异和使用抗生素情况不同以及各地卫生条件不同等因素有关[12-14]。

ESBLs是由质粒介导，可经整合、转导、转化等方式在异种或同种细菌间传播，并融合其他耐药基因，造成ESBLs菌株多重耐药细菌的产生和广泛传播。产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株相比，耐药现象更严重，其对临床常用的头孢菌素类、喹诺酮类、青霉素类、单环类抗菌药物的耐药性较高，还会对磺胺类、氨基糖昔类、氟喳诺酮等抗菌药物产生多重耐药现象，易诱发医院内交叉感染[15-17]。本研究中，BlaCTX-M-9、BlaCTX-M-1对头孢唑林、头孢曲松、头孢噻肟的耐药率为100%。ESBLs属于丝氨酸蛋白酶的衍生物，能水解所有头孢菌素类、青霉素类和单环β-内酰胺类氨曲南等，故产生耐药。BlaCTX-M-9、BlaCTX-M-1对左氧氟沙星耐药率>90%。研究显示，质粒介导的喹喏酮类的耐药基因qnr和aac（6'）-Ib-cr，耐药机制与BlaCTX-M相同[18-20]。故BlaCTX-M通过整合、转导、转化等方式对喹诺酮类药产生耐药。与BlaCTX-M-9相比，BlaCTX-M-1对头孢他啶、氨曲南、头孢吡肟耐药率较高，这可能与BlaCTX-M-15亚型有关。因240（D240G）和Ambler（P167 S/T/Q）位点出现替代，造成BlaCTX-M-15的β 侧链与Ω 环的活性位点易与头孢吡肟、氨曲南、头孢他啶结合，使BlaCTX-M-1对上述抗菌药物的水解活性进一步提高。

综上所述，大肠埃希菌产ESBLs携带率较高，BlaCTX-M为最常见分型，并以BlaCTX-M-9型为主，不同基因型ESBLs耐药机制存在一定差异，临床需根据药敏实验结果选择合适的抗菌药物。