不同浓度A549细胞上清液对人骨髓间充质干细胞迁移的影响*

沈雷 姜杨 张善强 金海峰 姚立杰 张嵩 刘丹阳 李永涛王璐璐

每年全世界死于肺癌的有60万人[1]，目前各种方法仍无法阻止肺癌发展[2]。研究认为，肺癌组织含有的肺癌干细胞可能来源于间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）[3-4]。MSCs具有向远处组织定向迁移等能力，还能够成为肿瘤样细胞[5]。目前认为，结肠癌或乳腺癌等恶性肿瘤发生发展及肿瘤干细胞的形成均与MSCs密切相关[6]。但是肺癌微环境招募MSCs迁移的影响还需要深入研究。

趋化因子是一类肽类家族，该类因子与MSCs表面受体相互结合，具有促进MSCs等细胞迁移的作用[7]。趋化因子-8（C-X-C motif chemokine ligand-8，CXCL-8）随着结肠癌发展呈现高表达，与结肠癌转移密切相关[8]。但是基于CXCL-8的A549细胞与MSCs之间的关系还鲜见报道。本实验从趋化因子角度验证不同浓度A549细胞上清液对hBMSCs细胞迁移的影响，为靶向抑制MSCs迁移到肺癌微环境奠定研究基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂、仪器 研究时间为2018年1月-2019年10月，人A549细胞购于武汉普诺赛生命科技有限公司；人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）由本实验室保存。α-MEM培养基、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）购自美国Thermo公司；MTT、二甲基亚砜（DMSO）购于Sigma公司；RIPA细胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA蛋白检测试剂盒为碧云天生物公司产品，小鼠抗人CXCL-8单克隆抗体和小鼠抗人β-actin抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG为英国Abcam公司产品；人Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K的ELISA试剂盒购自美国R&D公司。日本Olympus公司的BX50型倒置显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 含10%FBS的DMEM培养基培养A549细胞。含10%FBS的α-MEM培养基培养hBMSCs。所有细胞均未出现衰老或死亡现象。

1.2.2 实验分组 5.5×106A549细胞在37 ℃，5%的CO2培养6 h后，800 r/min离心3 min，提取A549细胞上清液。将A549细胞上清液用含1%FBS的α-MEM培养基分别按体积比5%、25%稀释为条件培养基（conditioned medium，CM）。以此两种条件培养基分别培养hBMSCs为5%A549-CM组、25%A549-CM组，无任何刺激的hBMSCs为对照组。

1.2.3 Transwell细胞迁移实验 1.0×104hBMSCs置于孔径0.8 μm的Transwell细胞小室内，下层腔室加入5%、25%条件培养基或正常培养基，37 ℃，5%的CO2继续培养18 h后：棉签擦除Transwell细胞小室内细胞，0.01 mmol/L PBS清洗3次，2 min/次；4%多聚甲醛溶液室温固定1 h，0.01 mmol/L PBS清洗3次，1 min/次；1%结晶紫染色30 min。Image-Pro Plus 6.0.1软件计算hBMSCs细胞迁移数目。

1.2.4 ELISA ELISA试剂盒检测各组hBMSCs裂解液的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白含量。

1.2.5 Western blot RIPA细胞裂解缓冲液裂解5.5×106各组hBMSCs，BCA蛋白定量检测试剂盒检测总蛋白浓度，分别进行ELISA和Western blot实验。45 μg蛋白以10% SDS-PAGE电泳90 min后转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭1 h，添加小鼠抗人CXCL-8单克隆抗体（1︰300）和小鼠抗人β-actin抗体（1︰700），4 ℃过夜后；再添加HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1︰400），室温孵育3 h；ECL发光液显影成像，IPP 6.0.1软件分析各蛋白条带相对吸光度值，β-actin为内参对照。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料用（）表示，两组间比较来用t检验，多组比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A549细胞上清液对hBMSCs迁移的影响 对照组、5%A549-CM组、25%A549-CM组hBMSCs细胞迁移数目分别为（1 452.25±13.57）、（3 574.16±15.85），（4 523.11±13.35）个。对照组、5%A549-CM组、25%A549-CM组hBMSCs细胞迁移数目逐渐升高，差异有统计学意义（F=145 046.61，P<0.01）。

2.2 A549细胞上清液对hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表达的影响 与对照组比较，5%A549-CM组、25%A549-CM组hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表达均明显增高，差异均有统计学意义（P<0.01），见表1。

表1 A549细胞上清液对hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表达的影响[μg/mL，（）]

表1 A549细胞上清液对hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表达的影响[μg/mL，（）]

*与对照组比较，P<0.05；#与5%A549-CM组比较，P<0.01。

2.3 A549细胞上清液对hBMSCs的CXCL-8蛋白表达的影响 对照组、5%A549-CM组、25%A549-CM组hBMSCs的CXCL-8蛋白表达分别为（0.51±0.01）、（0.73±0.05）、（1.39±0.06），差异有统计学意义（F=2 435.61，P<0.01）。25%A549-CM组CXCL-8蛋白表达明显比其余两组增高，见图1。

图1 A549细胞上清液对hBMSCs的CXCL-8蛋白表达的影响

3 讨论

肺癌发病部位比较隐蔽，采取放射或化学药物治疗后，患者免疫力低下、并发症较多等问题给患者身体和心理均带来极大痛苦。癌细胞从原位置扩散至周围或至远处组织器官的过程中会产生一系列反应，癌细胞转移约占恶性肿瘤死亡率的90%[9]。MSCs具有多分化、定向归巢能力，与肿瘤细胞干性特征相类似，虽然MSCs可能是攻克恶性肿瘤的重要细胞治疗手段，但是MSCs对肿瘤组织发挥作用的前提是MSCs归巢到肿瘤微环境内，目前关于MSCs迁移到恶性肿瘤组织的机制还不清楚。

本实验观察A549细胞对MSCs迁移的影响，结果发现，25%A549-CM组hBMSCs细胞18 h迁移率最明显，A549细胞对hBMSCs促进细胞迁移的能力随着A549条件培养基的浓度增高而逐渐升高，这可能是由于A549恶性肿瘤细胞能够分泌促进肿瘤自身生长的炎症因子或趋化因子有关[10]，这些活性因子对促进肿瘤等细胞移动具有重要意义。研究显示MSCs能促进胃癌细胞增殖或迁移，胃癌细胞与MSCs共培养时，MSCs能够促进胃癌细胞增殖或迁移，更促进胃癌移植瘤生长[11]。MSCs分泌趋化因子CCL5等趋化因子，增强了乳腺癌细胞运动性，侵袭性和转移能力[12]。

CXCL-8又称为IL-8，能促进高糖或缺氧环境下MSCs的增殖或迁移[13]。IL-8与胃癌、前列腺癌等恶性肿瘤的分级分期密切相关[14]，从趋化因子角度，揭示A549肺癌微环境对MSCs的影响具有较大影响。5%A549-CM组、25%A549-CM组细胞上清液中CXCL-8蛋白含量均明显高于对照组，说明A549细胞可以表达CXCL-8蛋白等趋化因子，CXCL-8能够与MSCs表面CXCR1/2受体特异结合，活化细胞迁移或增殖等过程[15]。实验发现5%A549-CM组、25%A549-CM组hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表达均明显上调，这与研究发现的CXCL-8蛋白能够激活Erk通路促进甲状腺癌细胞增殖或迁移的研究结果相一致[16]。当PI3K-Erk信号通路被激活后，细胞微丝微管发生收缩移动，细胞在细胞外基质会形成粘连，而细胞膜向前形成突出物，再以附着力和伪足作为支点，细胞整体向前移动，当细胞移动离开后，这些粘附点就会分解，多次这样的循环使细胞能四处移动。肌动蛋白会在细胞边缘聚合形成突出物，与整合素连结的细胞骨架可调节细胞对于细胞外基质的附着能力[17]。由此可见细胞骨架和基质蛋白酶在细胞移行过程中扮演着重要的角色，关于CXCL-8诱导肺癌等恶性肿瘤细胞招募MSCs移动的机制还需要进一步确定。

综上所述，A549细胞上清液含有的CXCL-8蛋白能激活hBMSCs内PI3K-Erk信号通路，促进hBMSCs迁移，这对揭示肺癌干细胞来源具有重要意义。