脑肠肽在大鼠胃窦、结肠、下丘脑组织与血清中的表达影响*

高娜 彭玉 刘启艳 庞平

脑肠肽是指在胃肠道和脑中双重分布的肽类统称，目前已发现的50多种胃肠肽中，至少有20多种也分布于脑中[1]。LP、NPY、CCK-8是三种重要的脑肠肽，近年来对三种脑肠肽参与摄食行为调控报道较多，研究靶点多以血清或血浆为主，而作为脑肠肽分泌的重要器官-胃肠道、下丘脑相关组织研究报道相对较少[2-3]，对LP、NPY、CCK-8在胃窦、结肠、下丘脑组织与血清中的分布规律与调控摄食行为作用是否存在关联性不详。为此，课题组将胃窦、结肠、下丘脑组织与血清中LP、NPY、CCK-8蛋白表达进行比较研究，以了解表达的差异性，以探究胃窦、结肠、下丘脑组织与血清中三种脑肠肽表达是否存在相关性，为拟开展厌食大鼠胃肠、下丘脑组织脑肠肽相关实验研究奠定基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 （1）实验动物：本实验时间为2018年7月，选取SPF级SD大鼠10只，由华中农业大学国家实验动物中心提供[许可证号SYXK（鄂）2015-0084]，体重（150±10）g，雌雄各半，5只/笼，正常饲料饲养。饲养室温度20～25 ℃，湿度为45%～65%。光照12 h明暗交替。每日记录大鼠精神状态、饮食、毛发等。（2）试剂与仪器：CCK-8ELISA试剂盒（RA20802，Bioswamp），LPELISA试剂盒（RA20489，Bioswamp），NPYELISA试剂盒（RA20022，Bioswamp）等。EL10A自动酶标仪（BIOBASE），DEM-3自动洗板机（北京托普），ST70-2微孔板恒温振荡器（杭州米欧）。

1.2 方法 大鼠适应性喂养3 d，禁饮禁食12 h后依次采集血清、大鼠下丘脑、胃窦、结肠组织。3%水合氯醛6 mL/kg麻醉大鼠后股动脉采血并脱颈处死。组织剪从枕骨大孔向矢状缝剪开至鼻准部，止血钳剥离颅骨，暴露完整的全脑组织，取全脑后冲洗表面血液，取腹面正中呈菱形的下丘脑组织；之后暴露腹腔，取全胃，截取沿距幽门0.5 cm前壁大弯侧的胃窦部组织，最后快速自肛门上2 cm取结肠约5 cm。上述组织均在取材后清洗干净，并迅速分装于EP管，-80 ℃保存待备检。全血分离出血清后-80 ℃保存待备检。

1.3 观察指标 采用酶联免疫吸附实验（ELISA法）检测血清、胃窦、结肠、下丘脑组织中LP、NPY、CCK-8蛋白的表达。具体操作参照LP、NPY、CCK-8ELISA试剂盒说明书进行。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料以（）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑肠肽在血清中的表达 LP、NPY、CCK-8蛋白浓度含量在血清中均有表达，三种脑肠肽在外周血清中含量以LP蛋白浓度含量表达最高，其次为NPY，最低为CCK-8。

2.2 脑肠肽在各组织中表达比较 LP蛋白在下丘脑中表达最高，三组比较差异有统计学意义（P<0.01），在胃窦表达分别与结肠、下丘脑中比较，差异均有统计学意义（P<0.01）；NPY蛋白在结肠中表达最高，三组比较差异有统计学意义（P<0.01），在胃窦中表达分别与结肠、下丘脑中比较，差异均有统计学意义（P<0.01）；CCK-8蛋白在下丘脑中表达最高，三组比较差异有统计学意义（P<0.01），在胃窦中表达分别与结肠、下丘脑中比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。见表1。

2.3 脑肠肽在组织与血清中表达比较 LP蛋白在血清表达中最高，在血清中的表达均显著高于在各组织中，差异均有统计学意义（P<0.01）；NPY蛋白表达在结肠组织最高，在结肠组织中的表达显著高于血清中，差异有统计学意义（P<0.01）；CCK-8蛋白表达在下丘脑组织最高，在下丘脑组织中表达显著高于血清中，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。

表1 脑肠肽在各组织中浓度表达比较[pg/mL，（）]

表1 脑肠肽在各组织中浓度表达比较[pg/mL，（）]

*与胃窦组织比较，P<0.01。

表2 脑肠肽在组织与血清中表达比较[pg/mL，（）]

表2 脑肠肽在组织与血清中表达比较[pg/mL，（）]

*与胃窦组织比较，P<0.01；＃与结肠组织比较，P<0.01；△与下丘脑组织比较，P<0.01。

3 讨论

近年来许多研究表明，脑-肠之间存在着一个复杂的神经-内分泌网络，这个网络将脑与胃肠道联系了起来，故被称为脑肠轴。脑肠轴是胃肠道功能与中枢神经系统相互作用的双向调节轴[4]。脑肠肽作为脑肠轴中重要的因子，在脑肠轴各个环节中，起着重要的调控功能作用[5]。这些脑肠肽不仅存在于胃肠道内，也存在于中枢神经系统中，它们一方面作为激素调节和影响于外周的器官，另一方面作为神经递质或调质作用于胃肠道感觉神经末梢或平滑肌细胞的相应受体，从而起到对胃肠功能的调控作用[6]。胃肠道是脑-肠轴体系中重要的参与者，动物营养物质的摄入与食欲息息相关，食欲调节包括长期和短期调节。长期食欲调节反映了机体的能量稳态，短期食欲调节是由胃肠道分泌的脑肠肽传递信号给下丘脑和脑干，通过交互作用来调节动物摄食开始或结束[7]。临床研究中也发现治疗小儿厌食症的机制也可能与其调节体内的食欲调节因子即脑肠肽有关[8]。越来越多法的研究发现多种脑肠肽参与摄食行为的调控，其中LP、NPY、CCK-8的研究报道较多[9-11]。

文献[12]报道LP是由肥胖基因编码的一种由167个氨基酸组成的蛋多肽类激素。它主要由白色脂肪组织产生及分泌，进入血液循环后，游离或与瘦素结合蛋白结合，最后通过多种组织及多种形式的瘦素受体，作用于中枢和外周的多个位点，调节机体能量平衡[13]。生理状态下LP通过与下丘脑相关的反馈环实现抑制摄食、增加能量消耗，在脂肪储存过程中发挥重要的作用。下丘脑部位存在多种调节进食的神经肽感受器分子，它们共同组成了一个食欲刺激网络[14]。本研究结果显示，在血清中LP蛋白浓度表达明显高于NPY和CCK-8，LP血清蛋白高浓度可能与其由脂肪细胞分泌后进入血液循环有一定关联性。LP在血清与组织中表达比较，在血清中的表达明显高于组织中（P<0.01），组织中以下丘脑蛋白浓度最高；下丘脑LP蛋白浓度高表达可能与下丘脑是调节进食的神经肽感受器分子有关。

NPY是一种含36个氨基酸，分子量为4.2 KD的小肽。迄今为止，已有大量研究表明，NPY广泛分布于哺乳动物的中枢和周围神经系统及组织、器官和腺体中，与许多部位的神经元中其他神经递质如去甲肾上腺素共存，还可以由非神经元细胞合成及释放。其中，在神经系统中的含量最高。NPY可促进动物的摄食行为、调控机体能量平衡，作为下丘脑食欲调节网络中重要的促食欲因子[15]。在胃肠道方面，NPY可促进十二指肠、空肠和结肠的蠕动，促进进食[16]。本研究结果显示NPY蛋白在结肠组织与下丘脑均较高，提示NPY在肠、中枢对食欲调节的功能相当，但结肠组织中的表达明显高于胃窦组织（P<0.01），由此推测结肠组织对胃肠脑肠肽以及食欲调节可能更显著。

CCK由肠道Ⅰ细胞分泌的33个氨基酸组成，前体具有115个氨基酸残基，分子形式包括CCK-5、CCK-7、CCK-8、CCK-18等。CCK主要存在于哺乳动物大脑和胃肠道中，是一种重要的肠道激素和神经递质[17]。CCK在脑内主要以CCK-8的形式存在，CCK-8具有CCK全部生物活性，可通过中枢、外周神经内分泌途径实现其抑制摄食、减缓胃肠运动、对消化功能的调节作用[18]。在中枢，CCK是一种致饱激素，其作用于下丘脑的食欲中枢，可产生致饱效应[19]。外周CCK既能与胃肠道迷走神经上CCK-1受体（CCK1，CCK1R）结合延迟胃排空，又能激活胃肠道迷走神经元上行通道产生信号冲动，传入下丘脑孤束核（NTS）神经元，减少摄食[20]。本研究结果显示，CCK-8蛋白浓度在下丘脑与结肠组织浓度均较高，提示CCK-8在中枢、肠对食欲调节的功能相当，但下丘脑组织表达明显高于血清（P<0.01），由此推测中枢、肠对食欲调节可能比外周血清更显著。

本研究结果显示，脑肠肽在下丘脑组织中含量偏高，推测下丘脑组织是中枢脑肠肽主要分泌部位，在食欲中枢调控中起着重要的主导作用。在胃肠道方面，研究结果显示胃窦、结肠组织均有LP、NPY、CCK-8三种脑肠肽表达，但结肠组织的蛋白浓度整体表达高于在胃窦组织中（P<0.01），由此推测结肠组织对胃肠脑肠肽以及食欲调节可能强于胃窦，占主要地位。

综上所述，胃窦、结肠、下丘脑组织和血清中LP、NPY、CCK-8蛋白均是参与摄食行为调控的重要肽类，脑肠肽在组织与血清表达存在的差异性，可能与肽类分泌部位、来源途径不同有关，与其发挥作用机理、靶点不同有关，本研究结果为今后探索“脑肠肽-食欲中枢”紊乱发生厌食的机理研究奠定了理论基础。