头针联合艾灸对缺血缺氧性脑损伤脑性瘫痪幼鼠记忆与学习能力及脑组织一氧化氮、谷胱甘肽过氧化物酶水平的影响※

周 钰 李秀娟 刘 欢 鲍毅梅 周 光

(新疆医科大学第一附属医院针灸推拿科，新疆 乌鲁木齐 830011)

小儿脑性瘫痪(以下简称脑瘫)是由于大脑先天性发育缺陷或获得性脑损伤(如早产、缺血缺氧、感染等)所致，主要表现为运动障碍，伴或不伴感知觉及智力缺陷，已经成为导致儿童神经性残疾中常见疾病之一[1-2]。目前，临床上对于小儿脑瘫的治疗原则是早期诊断、早期干预、长期康复，利用各种综合治疗措施纠正异常的运动和姿势，减轻伤残程度，促进患儿正常发育[3-5]。针灸疗法在小儿脑瘫的治疗中发挥了重要作用，在改善脑瘫患儿语言障碍，提高肢体功能，促进患儿健康成长方面具有确切疗效[6-8]。为进一步探讨针灸治疗小儿脑瘫的作用机制，我们通过建立缺血缺氧性脑损伤脑瘫幼鼠模型，观察头针联合艾灸对幼鼠记忆与学习能力的影响，以及幼鼠脑组织一氧化氮(NO)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)表达水平的变化，以明确其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)Wistar幼鼠120只，日龄7 d，体质量25～30 g，雌雄不限，新疆医科大学第一附属医院医学研究中心动物实验室提供，实验动物许可证号：SYXK(新)2018-0001。

1.2 实验针具及艾条 0.18 mm×15 mm一次性不锈钢毫针(贵州安迪药械有限公司)；艾条选用清艾灸条(南阳汉医艾绒有限责任公司)。

1.3 主要实验仪器及试剂 Morris水迷宫实验系统(成都泰盟科技有限公司)；NO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；GSH-Px检测试剂盒(上海索宝生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制作[9]

1.4.1.1 缺血手术 将幼鼠在乙醚密闭玻璃罐内麻醉，消毒后在操作台上固定，颈正中切口钝性分离肌肉组织、迷走神经，暴露左颈总动脉，用6-0号尼龙线结扎，离断动脉后缝合消毒包扎，手术时间控制在5 min以内，术后观察2 h，无呼吸抑制、颈动脉出血等表示缺血造模成功。

1.4.1.2 缺氧过程 将缺血模型成功的幼鼠放入缺氧箱中(氮气92%，氧气8%)2.5 h，之后给予正常浓度氧气供应，并于1 h后做行为评定，以平衡异常、不能翻身初步判定是成功模型，3 d后各组幼鼠再进行步伐失误及平衡木测试，步伐失误率明显增加及平衡木试验得分明显增高，表示缺血缺氧造模成功。

1.4.2 治疗方法 将缺血缺氧造模成功的120只幼鼠随机分组为对照组、头针组、艾灸组及联合组，每组30只。

1.4.2.1 对照组 不给予任何治疗措施。

1.4.2.2 头针组 造模成功后第3 d开始行头针针刺治疗。①选穴：头针顶颞前斜线(双侧)与顶颞后斜线(双侧)及百会。②定位：结合动物与人骨度类比，并参照《中国兽医针灸学》[10]定位，顶颞后斜线于百会(顶骨的正中点)至曲鬓(耳缘和耳尖水平交点)连线[11]，顶颞前斜线于顶颞后斜线前0.1寸。③方法：穴区常规消毒，使用0.18 mm×15 mm一次性不锈钢毫针，头针从百会进针，顺从顶颞前、后斜线走行沿头皮斜刺，百会沿头皮向后针刺，深度4～5 mm，留针30 min，每日1次，共治疗32 d。

1.4.2.3 艾灸组 造模成功后第3 d开始行艾灸治疗。①选穴：夹脊(双侧)、百会及足三里(双侧)。②定位：结合动物与人骨度类比，并参照《中国兽医针灸学》[10]定位，百会于顶骨的正中点，夹脊于脊柱旁开约3 mm，足三里于小鼠下肢膝关节后外侧腓骨小头下方约5 mm处。③方法：首先用固定器固定幼鼠，然后采用清艾条依次悬于穴位上方2 cm处(幼鼠较小，夹脊按1个穴上下往返灸治疗)，采用温和灸，每穴5 min左右，每日1次，共治疗32 d。

1.4.2.4 联合组 造模成功后第3 d开始行头针联合艾灸治疗。选穴、定位及方法同头针组及艾灸组。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 记忆与学习能力 采用Morris水迷宫实验对幼鼠的记忆与学习能力进行检测[12]。Morris水迷宫实验是迫使幼鼠游泳并使其学习寻找隐藏于水下的平台，水池直径1.5 m，水深30 cm，平台位于迷宫的东北象限，平台直径12 cm，水面下5 cm，水温22～25 ℃。各组幼鼠最后1次治疗结束后开始训练，训练时设定最长游动时间为120 s，分别从正东、正南、正西、正北4个象限入水，完成4个象限的训练为1个循环，120 s后未找到平台将引导其至平台，并静置30 s引导其学习与记忆。每只幼鼠每日实验1次，共进行5 d，前4 d为训练，第5 d为测试，记录各组幼鼠的逃避潜伏期及游泳距离，逃避潜伏期为从入水到找到水下隐蔽平台并站立其上所需的时间，游泳距离为从入水到找到水下隐蔽平台的游泳总路程。

1.5.2 NO及GSH-Px检测 各组幼鼠在做完Morris水迷宫实验后腹腔注射水合氯醛麻醉，快速取出脑组织，分离两侧海马区后固定于10%的中性福尔马林液内，-70 ℃保存。采用硝酸还原酶法测定海马区NO水平，二硫代二硝基苯甲酸法测定海马区GSH-Px水平，均严格按照试剂盒说明进行。

2 结果

2.1 各组幼鼠逃避潜伏期及游泳距离比较 见表1。

表1 各组幼鼠逃避潜伏期及游泳距离比较

由表1可见，头针组、艾灸组及联合组幼鼠逃避潜伏期及游泳距离与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，均缩短。联合组幼鼠逃避潜伏期及游泳距离与头针组和艾灸组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，联合组逃避潜伏期及游泳距离均短于头针组和艾灸组。头针组与艾灸组幼鼠逃避潜伏期、游泳距离组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组幼鼠海马区NO及GSH-Px水平比较 见表2。

表2 各组幼鼠海马区NO及GSH-Px水平比较

由表2可见，头针组、艾灸组及联合组幼鼠海马区NO和GSH-Px水平与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，NO水平降低，GSH-Px水平升高。联合组幼鼠海马区NO及GSH-Px水平与头针组和艾灸组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，联合组对NO及GSH-Px水平改善均优于头针组和艾灸组。头针组与艾灸组幼鼠海马区NO和GSH-Px水平组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

脑瘫患儿缺血缺氧性脑损伤的基础主要是窒息缺氧,导致脑内血管的血液灌注和微循环交换的机制受损，脑组织发生缺血缺氧后可逐渐出现神经细胞的不断凋亡，当到达凋亡高峰以后，仍然没有得到足够的血液供给，不能抑制神经细胞的继续凋亡，就会造成局部脑组织坏死，进而出现一系列神经功能障碍，如果可以得到及时有效的干预措施,就有极大可能阻断神经细胞凋亡的进程，更甚者逆转凋亡，进一步挽救神经细胞，从而有效保护脑组织[13-14]。有研究表明，缺血缺氧性脑损伤发生后可诱导炎症细胞浸润，释放出各种具有神经毒性的物质，如氧自由基、兴奋性氨基酸、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等，这也是发生神经细胞损害的主要原因[15-17]。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，可使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，有效清除氧自由基，防止神经细胞受到氧化损伤[18]。NO是大脑血管内的神经活性物质，可以不同程度的调节血管张力，并且辅助细胞间的信息传递，研究表明脑缺血发生的12 h后，可在损伤部位的血管或神经细胞里出现过量的NO，破坏微循环，这也是迟发性神经元损伤的重要原因，另外在缺血缺氧性脑损伤发生后，NO还可与超氧自由基产生反应，形成具有细胞毒性作用的亚硝酸阴离子和过氧亚硝酸盐，对脑组织造成损伤[19-20]。

小儿脑瘫属中医学五迟、五软、五硬等范畴，其基本病机是肾精亏虚，气血不足。明·徐春甫《古今医统大全》中言：“有日月不足而生者，或服坠胎之剂不去而竟成胎者。耗伤真气及降生之后，精气不充，筋骨痿弱，肌肉虚瘦，神色昏慢，致使头、项、手、足、身体软弱，名为五软。”认为其病因为父母精血虚弱，先天之气不充，导致胎气不足，又后天失养，脑络受损，脏腑功能失调，而发育异常。故治疗应以扶正益髓、温经通络、益气活血为原则。《素问·脉要精微论》言：“诸阳之神气皆上会于头，诸髓之精气皆上聚于脑，头为精明之府。”“头为诸阳之会。”故我们选用头针联合艾灸治疗。艾灸和头针都是依据中医经络学说治病防病的常用方法，艾灸是借助艾火的温热作用，具有温通气血、扶正祛邪的功效，头针则直接作用于腧穴，疏通经络，改善周围气血运行。夹脊位于背部脊椎两旁，具有调整脏腑气血的功能，《华佗别传》有言：“又有人病脚躄不能行……后灸愈。灸处夹脊一寸上下行，端直均调如引绳也。”就是对艾灸夹脊穴治疗腿脚运动功能障碍的记载。百会位于头部巅顶，属督脉，督脉又归属于脑，头为诸阳之会，百脉之宗，而百会穴则为各经脉气会聚之处，所以艾灸和针刺百会，可通调全身经脉，振奋阳气，具有醒脑开窍、安神定志、升阳举陷、益气固脱的功效。足三里属足阳明胃经，胃的下合穴，传统的保健要穴，脾胃为后天之本，艾灸足三里可生发胃气，使气血生化有源，具有补中益气、通经活络、扶正祛邪的功效，唐·王焘《外台秘要》有言:“三里养先后天之气,灸三里可使元气不衰,故称长寿之灸。”顶颞前斜线及顶颞后斜线则是根据现代头针理论，其下有中央前回、中央后回以及旁中央小叶等，针刺治疗可有效改善运动及感觉障碍[21]。

本研究结果显示，与对照组比较，头针组和艾灸组采用头针和艾灸治疗后均可明显缩短幼鼠逃避潜伏期及游泳距离(P<0.05)，降低NO水平(P<0.05)，升高GSH-Px水平(P<0.05)，而联合组采用头针联合艾灸治疗具有明显的协同增效作用，较头针组和艾灸组，可以进一步缩短幼鼠逃避潜伏期及游泳距离(P<0.05)，改善NO及GSH-Px水平(P<0.05)，艾灸温补阳气，头针疏通经络，一补一通，使气血开之有源，导之有流，从根本上改善了头部气血运行，促进功能恢复。综上所述，头针联合艾灸可明显提高缺血缺氧性脑损伤脑瘫幼鼠的记忆与学习能力，其作用机制可能与降低NO水平，升高GSH-Px水平，改善微循环，抑制神经细胞凋亡，减轻脑组织损伤有关。