分子伴侣介导的自噬在阿尔茨海默病中作用的研究进展

陈俊慧，谷有全，姚利和，张 薇，王怀祥

1. 兰州大学第一医院神经内科，兰州 730013；2. 兰州大学第一临床医学院，兰州 730013；3. 兰州大学第二医院口腔科，兰州 730030；4.甘肃省张掖市甘州区人民医院重症医学科，张掖 734000

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病。其起病隐匿且呈渐进性发展，临床主要表现为记忆力下降、认知功能减退等，最终可导致患者完全丧失生活自理能力。AD 的病理特征主要表现为由细胞外β 淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积导致的老年斑（senile plaque，SP），以及由细胞内Tau 蛋白（Tau protein）过度磷酸化导致的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）［1-2］。目前，世界范围内AD 患者约有5 000 万，预计到2050 年将增加到1.52 亿；且全球每年因AD 造成的卫生经济负担约达1 万亿美元［3］。与此同时，临床上仍缺乏能够有效治愈或阻止该疾病进展的方法。因此，研究AD疾病的动态变化并探讨AD病理发生发展的机制，对寻找预防和治疗该疾病的新靶点至关重要。

自噬（autophagy）是一种在进化过程中高度保守的细胞生理过程，是真核细胞内清除衰老或受损细胞器和长寿命蛋白质的主要途径，在维持细胞内稳态和细胞组分再利用方面发挥重要作用。根据向溶酶体转运底物的不同机制，自噬被分为以下3种类型：①巨自噬，即自噬体的双膜囊泡包裹细胞质内容物并递送至溶酶体，以完成降解［4］。②微自噬，即溶酶体膜直接包裹长寿蛋白质等，并在溶酶体内降解［4］。③分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA），即分子伴侣与胞质内蛋白质结合并转至溶酶体膜上，由溶酶体跨膜蛋白将该蛋白质转运至溶酶体腔内，再由溶酶体酶进行降解［5-10］。越来越多的证据显示，CMA 是异常蛋白质早期降解的重要途径，且该途径的失活可能会促进早期AD的进展。

1 CMA 的发生过程和涉及的伴侣、受体与底物

1.1 CMA的发生过程

CMA 是一种依赖溶酶体的选择性蛋白降解途径，可分为4 个步骤［11］：①热休克同源蛋白70 （heat shock cognate protein 70，HSC70）与底物蛋白结合，并转运至溶酶体膜上［12］。②溶酶体相关膜蛋白2A（lysosomalassociated membrane protein 2A，LAMP2A）与底物蛋白结合，并使其发生去折叠化［13］。③底物蛋白被LAMP2A多聚体运送至溶酶体腔内。④在溶酶体腔内，底物蛋白被溶酶体酶溶解。

1.2 CMA的伴侣、受体及其底物

1.2.1 伴侣蛋白 HSC70 位于细胞内和溶酶体中［11-12］。胞质内HSC70（cyt-HSC70）通过与底物蛋白的KFERQ［赖氨酸（Lys，K）-苯丙氨酸（Phe，F）-谷氨酸（Glu，E）-精氨酸（Arg，R）-谷氨酰胺（Gln，Q）］识别基序相互作用［14］，将底物蛋白运送至溶酶体膜上。在这一运送过程中，除HSC70 外，热休克蛋白40 （heat-shock protein 40，HSP40）、HSC70 相互作用蛋白（HSC70-interacting protein，HIP） 和HSC90 辅伴侣蛋白（HSPorganizing protein，HOP）等其他辅助伴侣均可与HSC70形成伴侣复合物，促进底物蛋白的转运。随后，溶酶体腔内的HSC70（lys-HSC70）负责将底物蛋白从溶酶体膜转运到溶酶体腔内。

1.2.2 受体蛋白 LAMP2A 是一种溶酶体相关膜蛋白。前体LAMP2mRNA通过选择性剪接可获得3种蛋白产物，即LAMP2A、LAMP2B 和LAMP2C，且仅有LAMP2A 可在CMA的发展过程中发挥作用。单体LAMP2A存在于溶酶体膜上，可与膜结合的伴侣蛋白HSC70、HSP90、HSP40、HIP和HOP形成伴侣复合物，参与底物蛋白的去折叠过程。该过程发生在底物蛋白从溶酶体膜向溶酶体腔内转运之前。此外，在溶酶体膜上底物蛋白复合物与单体LAMP2A 结合可驱动LAMP2A 的多聚化，该多聚体可负责将底物蛋白复合物转运至溶酶体腔内。

1.2.3 底物 CMA 底物是一类含有KFERQ 基序的蛋白质。KFERQ 是一组包含酸性氨基酸［天冬氨酸（Asp，D）、Glu］ 残基、碱性氨基酸［Arg、赖氨酸（Lys，K）］残基、疏水性氨基酸［Phe、异亮氨酸（Ile，I）、亮氨酸（Leu，L）、缬氨酸（Val，V）］残基和1 个Gln 组成的五肽基序［11-14］。该基序主要介导底物蛋白与HSC70 的相互作用，存在于约40%的胞质蛋白［如钙调磷酸酶调节因子1（regulator of calcineurin 1，RCAN1）］中。此外，某些蛋白可通过翻译后修饰等产生KFERQ 基序，从而扩大了CMA的底物数量。

2 CMA参与的一般生理过程

CMA 可参与机体的多种生理过程，具体如下：①应激反应中的代谢过程。在应激条件下，如长期饥饿（12～20 h）、氧化应激或暴露于有毒化合物等，CMA 可最大程度地被激活［15-18］，通过选择性降解组织中非关键蛋白来保护关键蛋白不被降解［17，19］。②蛋白质的代谢过程。通过CMA 途径，对带有CMA 靶向基序的发生失活、错误折叠或去折叠的蛋白质进行降解，防止其在胞内的过度积累［17，19］。③糖、脂质的代谢过程。CMA 通过选择性降解糖、脂质代谢相关途径中的关键酶或相关基因等，调节糖、脂质的代谢［20-23］。④其他调节过程。在特定的抗原呈递细胞中，CMA 有助于主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）介导的内源性抗原的呈递；CMA还可通过降解肌细胞增强因子2D（myocyte enhancer factor 2D，MEF2D）的存活因子来保护神经元，调节转录因子PAX2（paired box gene 2）的降解来控制肾脏中的细胞增殖［15，24］。

3 CMA在AD病理变化中的作用

3.1 CMA对Aβ直接或间接的降解作用

Aβ 聚集在细胞外是AD 的关键病理过程，被认为是神经元变性的主要原因。Aβ 是由淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）在细胞内被β 分泌酶（beta-secretase 1， BACE1） 和 γ 分泌酶 （gammasecretase） 相继水解加工后形成。有研究证据提示，CMA 可能是APP 降解的重要途径。Park 等［25］研究显示，APP 的C 端含有1 个KFERQ 基序（763KFFEQ768），其可增加APP 或其裂解产物成为CMA 底物的可能性。Dou等［26］设计并合成了含有3 个CMA 基序的Aβ 寡聚体结合肽，通过实验发现该结合肽可帮助Aβ 寡聚体进入溶酶体进行降解，从而减少该寡聚体在细胞外的聚集；该策略可能对AD 的治疗具有重要意义。同时也有观点［15，27］认为，CMA 不能直接降解APP，而是通过调节其他降解途径或通过某种中间物质介导来间接促进Aβ寡聚体的降解。Bourdenx 等［5］研究证实，在给予CMA激活剂诱导后，成熟淀粉样沉积物的数量会有所下降、体积有所减小，提示CMA 减轻了AD 的病理变化。综合上述研究可以发现，CMA 可以以直接或间接的方式促进Aβ 寡聚体的降解，减少细胞外Aβ 的聚集，进而抑制AD 病程的进展。

3.2 CMA对Tau蛋白的降解作用

Tau 蛋白（Tau protein）是一种高度可溶的天然未折叠蛋白，几乎不含二级结构。其结构域可分为包含微管结合基序的碳末端和从微管表面伸出的氮末端。Tau蛋白能够发挥细胞骨架元件的作用，并参与轴突的运输。异常Tau 蛋白可从微管中解离，组装形成最初的成核物质，该物质进一步沉积可形成有毒的寡聚体和成对的螺旋丝，其中成对的螺旋丝是NFTs 的主要组成成分；而NFTs 是AD 主要病理特征之一［28］。Tau 蛋白序列中存在CMA 的2个靶向基序，即336QVEVK340和347KDRVQ351，可与胞质伴侣HSC70 结合，因此CMA 是Tau 蛋白降解的重要途径。Bourdenx等［5］研究结果显示，在神经元细胞中，CMA途径失活可导致蛋白质的沉积，而该异常沉积则易导致蛋白质发生错误折叠。因此，CMA 途径的失活是引起蛋白质发生错误折叠的关键原因。Bourdenx 等［5］和Caballero等［6］的研究结果显示，Tau蛋白的异常聚集是早期AD 的一种病理改变，由于CMA 是Tau 蛋白降解的重要途径，故CMA 活性的上调可阻止该蛋白发生沉积；继而提示，CMA途径的调节或将是未来治疗AD的一个新方向。

3.3 CMA对RCAN1的降解作用

钙调磷酸酶（calcineurin，CaN）是一种Tau 蛋白的去磷酸化酶，而由RCAN1编码的RCAN1.1L 蛋白可抑制CaN 的活性。Liu 等［27］研究表明，RCAN1 含有CMA 识别基序，可由CMA 途径进行降解。且CMA 途径是RCAN1 的重要降解方式［29-31］。在AD 疾病中，CMA 途径的失活可导致RCAN1 水平升高，进而抑制CaN 的去磷酸化作用，使过度磷酸化的Tau蛋白大量积累，导致细胞内NFTs沉积。此外，RCAN1水平的升高还可以加快APP的多个水解过程，造成细胞外Aβ 寡聚体的沉积，从而促进AD疾病的进展［32］。

4 CMA 与Tau 蛋白翻译后修饰产物的关系

如前所述，Tau 蛋白的聚集是AD 早期的病理改变之一，而CMA 是早期Tau 蛋白降解的重要途径。当Tau 蛋白未被及时清除时，则易发生相关修饰，如磷酸化、乙酰化、泛素化等。而Tau 蛋白修饰后的产物是通过CMA途径降解还是转换到其他途径降解，成为了当下研究的重要问题，这也将为探索AD进展的具体机制及治疗方式提供新的思路。

4.1 CMA与磷酸化Tau蛋白的关系

磷酸化是最为常见的Tau蛋白的翻译后修饰，发生在NFTs 形成之前。Tau 蛋白的磷酸化可降低其对微管的亲和力，导致神经元细胞骨架不稳定。该磷酸化常通过以下2 种途径发生。①PI3K-AKT-GSK-3β 通路：磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路的激活可使丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonineprotein kinase，AKT）发生磷酸化，随后磷酸化的AKT可引起糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）发生磷酸化，从而抑制GSK-3β 的活性。由于GSK-3β 可促进Tau 蛋白多个位点磷酸化导致Tau 蛋白过度磷酸化，故当PI3K 通路被阻遏时，Tau 蛋白将发生过度磷酸化［33］。②CDK5-P25 途径：细胞周期蛋白依赖性激酶5（cyclin-dependent kinase 5，CDK5）是CDKs 家族的成员之一，主要在神经系统中发挥作用，参与AD早期NFTs的病理形成。当神经元受到应激或死亡信号刺激时，大量Ca2+进入细胞质导致钙蛋白酶被激活。激活后的钙蛋白酶将细胞周期蛋白依赖性激酶5 调节亚基1（cyclindependent kinase 5 regulatory subunit 1，P35）切割成P25，后者可激活CDK5，从而导致Tau 蛋白的过度磷酸化。同时，CDK5 磷酸化的增加也可上调GSK-3β 的活性，使Tau蛋白发生过度磷酸化［34］。

过度磷酸化的Tau 蛋白易沉积在细胞内形成NFTs。因此，降解过量的磷酸化Tau 蛋白是阻止NFTs 形成的重要途径之一。相关实验［35］证实，Tau 蛋白被磷酸化的位点不同，则使得其与溶酶体作用时发生障碍的形式不同，如不能与溶酶体膜结合或不能从溶酶体膜转移到腔内，从而不能参与CMA 途径的降解。此时，该磷酸化Tau 蛋白需通过与微管相关蛋白1 轻链3α （microtubule associated protein 1 light chain 3 alpha，MAP1LC3A） 即LC3相互作用，经巨自噬途径被降解［36］。在生理条件下，未修饰的Tau 蛋白主要通过CMA 途径降解来维持在胞内的动态平衡。而磷酸化后的Tau蛋白主要通过巨自噬途径进行降解，但经由该途径降解的效率远低于CMA 途径，从而导致磷酸化的Tau 过量沉积，进而加重AD 病理的进展。

4.2 CMA与乙酰化Tau蛋白的关系

乙酰化也是常见的Tau 蛋白的翻译后修饰。Caballero等［6］证实，在AD中，底物Tau蛋白被乙酰化修饰后，会阻遏LAMP2A多聚体将CMA底物复合物从溶酶体膜转运至溶酶体腔内的过程，从而使CMA 途径失活。而后，乙酰化Tau蛋白会在细胞内发生聚集，并大量地向细胞外释放、扩散。这一过程增加了乙酰化Tau蛋白对神经元细胞的毒性作用。此外，Bourdenx 等［5］的实验模型证实，大脑中神经元的CMA 活性被抑制是发生在AD 中的早期事件，而在发生CMA 衰竭更早、更明显的神经元中存在有过量的Tau 蛋白。据此推测，CMA 途径在AD 早期异常Tau 的降解中起到关键作用，其或将为延缓AD 进展的临床治疗提供新的靶点。

乙酰化Tau 可导致CMA 途径失活，因此，了解其中的影响因素尤为重要。研究［37］显示，Tau 的乙酰化与S-亚硝酰化的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（S-Nitrosylated glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，SNO-GAPDH）相关；SNO-GAPDH 可协同增强Tau 蛋白乙酰化酶的活性、抑制Tau 蛋白去乙酰化酶［如Sirius n1（Sirti 1）］的活性，从而增加乙酰化Tau蛋白的总量。目前，已发现小分子物质亦可调节Tau 蛋白乙酰化水平。奥米加匹（CGP3466B）是一种GAPDH 亚硝基化的特异性抑制剂，可阻断GAPDH 和Sirt1的S-亚硝基化，下调Tau蛋白的乙酰化水平。Tau蛋白去乙酰化酶Sirt1的活性主要受辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）浓度的调节，辅酶NAD+的抑制剂Sarm1 蛋白可保持大脑中的NAD+水平，并阻止乙酰化Tau蛋白的累积；而使用Sirt1 抑制剂EX527 抑制Sirt1 的活性或用烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂FK866抑制NAD+的合成，则可导致Tau 蛋白乙酰化。此外，组蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）可使Tau 蛋白去乙酰化；非甾体抗炎药二氟尼柳（Diflunisal）或双水杨酸酯（Salsalate）可抑制Tau 蛋白乙酰化酶的活性，下调Tau 蛋白的乙酰化［37］。综上，在Tau 蛋白的乙酰化过程中存在多种调节因素，该因素可调控乙酰化Tau 蛋白对CMA 途径的抑制作用，这可能为临床治疗AD提供新的方向。

4.3 CMA与泛素化Tau蛋白的关系

泛素化也是常见的Tau蛋白的翻译后修饰。通常，泛素中有2个序列与CMA中涉及的KFERQ基序相匹配，提示细胞内泛素化的Tau 蛋白可直接经CMA 途径进行降解［10］。同时，在Hela 细胞和小鼠模型中进行的研究证实，CMA 还可以调节其他途径来降解泛素化的Tau蛋白。因此，泛素化Tau 蛋白可直接或者间接地由CMA 途径进行降解。

5 CMA中LAMP2A的调节

LAMP2A 是CMA 途径中的关键分子，其活性的调节可直接影响CMA 途径的活性。已有研究显示，LAMP2A的活性可由多种蛋白途径来调节，具体如下。

5.1 上调LAMP2A活性的途径

（1） GFAP 信号途径：胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）有非磷酸化和磷酸化2 种状态。非磷酸化的GFAP 能与LAMP2A 多聚体结合并使其保持稳定，继而上调CMA 途径的活性。而磷酸化的GFAP 可与非磷酸化的GFAP 形成二聚体，竞争性抑制LAMP2A 多聚体的稳定性，从而下调了CMA 的活性。PH 结构域富含亮氨酸重复序列的蛋白磷酸酶1（PH domain and leucine rich repeat protein phosphatase 1，PHLPP1）可使GFAP 去磷酸化，稳定LAMP2A 多聚复合物，从而上调CMA活性［8，38］。

（2）从头合成途径：蛋白质的从头合成途径是指由简单的小分子氨基酸合成复杂大分子的过程。在轻度氧化应激、遗传毒性损伤或缺氧的诱导下，LAMP2A 蛋白可通过从头合成途径增加LAMP2A 的表达水平，进而上调CMA的活性。

（3）LAMP2A 蛋白降解减少：LAMP2A 蛋白发生降解时，会先被转移到溶酶体膜的脂质微区［39］，由组织蛋白酶A 和金属蛋白酶进行双重切割，随后释放到溶酶体腔中进行快速降解。在生理条件下，LAMP2A 的半衰期约为36 h；但当饥饿持续超过48 h 后，其半衰期可延长至超过72 h，因降解减少导致溶酶体膜上的LAMP2A 相对增加。而在长期饥饿的状态下，驻留在溶酶体腔中的LAMP2A 会部分被转移至溶酶体膜上，进一步导致膜上的LAMP2A增加，继而上调CMA的活性［8］。

5.2 下调LAMP2A活性的途径

（1） EF1α 途径：延伸因子1α （elongation factor 1 alpha，EF1α） 可对LAMP2A 多聚复合物进行调节。EF1α 与磷酸化的GFAP 结合时，非磷酸化的GFAP 可与LAMP2A 多聚复合物结合并保持其稳定，从而上调CMA的活性。而三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）可介导EF1α 与磷酸化GFAP 发生解离，促进非磷酸化GFAP 从GFAP-LAMP2A 复合物中解离，同时可加速非磷酸化GFAP 转化为磷酸化GFAP，从而破坏LAMP2A 多聚复合物的稳定性，下调CMA的活性［8］。

（2）RARα 信号途径：视黄酸受体α（retinoic acid receptor α，RARα）不仅能直接抑制LAMP2A 介导的底物蛋白与溶酶体的靶向结合，还可抑制LAMP2A 参与底物蛋白向溶酶体腔内的转运。因此，RARα 可调节CMA途径的多个环节，从而下调CMA的活性［8］。

（3）CaN-NFAT1通路：研究［40］显示，CaN可通过去磷酸化来活化T 细胞核因子1（nuclear factor of activated T cell 1，NFAT1），而活化后的NFAT1 可直接结合LAMPA2 近端启动子区域，上调LAMP2A 的表达；CaN的抑制剂（如环孢菌素A）可降低细胞中CaN 的活性，影响CaN 介导的NFAT1 活化，继而下调LAMP2A 的表达，降低CMA的活性。

（4）VPS35突变：在生理条件下，高尔基复合体通过向溶酶体转运LAMP2A来调节CMA的活性。在携带有液泡蛋白分选相关蛋白35 （vacuolar protein sortingassociated protein 35，VPS35）突变的细胞中，多种溶酶体蛋白的运输发生了改变，造成溶酶体功能发生障碍，从而加速了溶酶体介导的LAMP2A降解过程，使CMA途径的活性下降［8，39］。

6 总结与展望

近年来，随着对自噬研究的不断深入， 我们逐渐认识到自噬异常可能是导致神经性退行性疾病发生发展的重要因素，CMA 在调控蛋白质质量平衡和AD 疾病进展中的作用也越来越明确。如前所述，CMA 可参与Aβ 和Tau 蛋白的清除及RCAN1 的降解。而乙酰化的Tau 蛋白可使CMA 途径失活，且该蛋白能够在细胞内聚集并向细胞外扩散。实验证实，CMA 途径在AD 早期的病理事件中起到关键作用，且CMA 的失活可促进早期AD 的进展。因此，确定CMA 途径与AD 早期病理事件关键分子的交互作用及其相关机制将成为下一步研究的重点。目前，Tau 蛋白和Aβ 的靶向药物均有了重大突破，美国食品药品监督管理局在2021 年6 月10 日批准靶向Aβ 的抗体Aducanumab 有条件上市，Tau蛋白的疫苗AADvac1 也有了突破性进展［41-43］。这将标志着针对AD 病理的药物研究已经成为当下的热点。因此，鉴于CMA 在AD 发生进展中的重要作用，研发高选择性的CMA 调节剂将是该领域面临的又一巨大挑战。总之，进一步明确CMA 在AD 进展中的作用，探索以调节自噬为靶点的相关研究，或将为AD 的治疗提供更为广阔的前景。