基于肝细胞癌可控纳米递药系统的应用研究〔1〕

王艳琴

(江西省中西医结合医院，江西 南昌 330003)

据统计[1]，肝癌是我国第二位的恶性肿瘤，每年的死亡人数超过10万，占世界肝癌死亡人数的40%左右。因此，对于肝癌的靶向性递药研究显得尤为重要。药物递释系统到达肿瘤部位后，仍然面临如何渗透入肿瘤内部、如何提高药物在肿瘤核心区域分布的问题。因此，构建能够靶向肝癌细胞，且具有高肿瘤穿透能力的靶向递药系统具有十分重要的意义。研究表明[2-3]，不同粒径的纳米粒对实体瘤的穿透能力和滞留能力有显著区别。小粒径(如粒径20 nm)纳米粒的穿透能力远远大于大粒径纳米粒(如粒径200 nm)，然而小粒径纳米粒在肿瘤部位的滞留能力却逊于大粒径纳米粒。为克服这一缺陷，本研究构建了可收缩纳米粒——修饰四氧化三铁纳米粒的凝胶纳米粒(Gel)。该纳米粒粒径为150 nm左右，在肿瘤部位具有较好的滞留能力。滞留于肿瘤后由于肿瘤部位酶的作用，使凝胶降解而释放出仅有10 nm的四氧化三铁纳米粒，从而有望具有更好的渗透性[4-6]。然而该策略仅有体外研究，尚无用于肿瘤靶向治疗的研究报道。本文拟采用此策略构建具有肿瘤微环境响应性的可收缩肝癌靶向递药系统，以期在具有良好肿瘤靶向性的同时，进一步提高递药系统对肿瘤的穿透性。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

ZNCL-T1000集热式恒温加热磁力搅拌器(西安予辉仪器有限公司)，DZF6050真空干燥箱(温州鼎力医疗器械有限公司)，lx73倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 主要材料

Gel、树枝状高分子聚合物聚左旋赖氨酸(DGL)和紫杉醇(PTX)(购自中国科学院成都有机化学有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)和荧光探针香豆素-6(购自美国Sigma公司)；RPMI-1640培养基(购自北京索来宝有限公司)；DAPI(购自苏州宇恒生物科技有限公司)。

1.3 载体材料的合成

精密称取凝胶纳米粒-探酰氯(Gel-COCl)100 mg和DGL-a-Co(OH) 1.5 g于250 mL烧瓶中，甲苯-四氢呋喃(3∶1)20 mL作为反应溶剂，三乙胺2 mL作为催化剂，在80 ℃条件下连续回流48 h(氮气保护)，得到的反应溶液趁热减压滤过并用四氢呋喃和蒸馏水反复清洗，得到的黑色固体置于60 ℃干燥箱中干燥24 h，至产物得到恒定质量，产量约为55.44%。紫外可见吸收光滑法测试合成表征药物载体材料的发光性能。

1.4 载PTX复合物的制备

精密称取DGL-Gel 4 mg，加入PTX无水乙醇溶液0.5 mL，边超声边滴加超纯水3 mL，探头超声(功率400 W，工作3 s，间隔6 s，超声10次)，4 000 r/min离心15 min，弃上清，取沉淀，加入质量浓度为10 mg/mL的泊洛沙姆188溶液5 mL，在探头超声条件下再经4 000 r/min离心15 min，取上清，冷冻干燥得到PTX-DGL-Gel。采用色谱分析技术证实DGL-Gel对PTX的测定无干扰。

1.5 体外溶血试验

实验结果发现，阴性对照管上层液体为无色透明，无溶血发生；阳性对照管呈澄明红色则发生了全溶血。PTX-DGL-Gel质量浓度为0.8 mg/mL时，溶血率为4.9%，溶血率随着质量浓度的上升而增大，当质量浓度达到4 mg/mL时，溶血率为68.7%。

1.6 生物相容性评价

将hepG2细胞1×104个/孔接种于96孔培养板，放入培养箱培养24 h，分别加入终质量浓度为5，10，15，20，25 mg/mL的PTX-DGL和PTX-DGL-Gel材料各200 μL，对照组加入等体积含血清培养基，每组设6 个复孔。继续培养24 h后，避光加入10 μg/mL的MTT 150 μL，37 ℃孵育4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 100 μL，用酶标仪检测490 nm波长处吸光度，计算细胞存活率。

1.7 细胞生长抑制率

调整hepG2细胞1×104/mL加入96孔培养板，分别加入PTX-DGL和PTX-DGL-Gel的质量浓度为0.005，0.010，0.050，0.100和0.500 μg/mL，同样MTT方法检测细胞生长抑制率。

1.8 细胞摄取试验

首先，构建Zn(z)-Cys(6)(简称C6)标记载体，制备C6-PTX-DGL和C6-PTX-DGL-Gel材料，荧光分光光度法测定C6载药量为21.46%。然后将hepG2细胞1×104/孔接种于6 孔培养板，培养24 h，吸弃培养液，用无血清培养液漂洗，加入2 mL无血清培养液稀释的游离C6溶液、C6-PTX-DGL和C6-PTX-DGL-Gel，使香豆素的终质量浓度为50 ng/mL；继续孵育4 h，吸弃含药培养液，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3 次，4%多聚甲醛37 ℃固定20 min，DAPI染色15 min，冷PBS洗3次，防荧光淬灭封片剂封片，于倒置荧光显微镜下观察分析。

1.9 统计学方法

2 结 果

2.1 生物相容性分析

hepG2细胞对PTX-DGL和PTX-DGL-Gel均有较好的生物相容性，细胞存活率随着质量浓度的增加而逐渐下降，同浓度下，PTX-DGL-Gel对细胞的存活率显著高于PTX-DGL，差异有统计学意义(P<0.05)(见图1)。

图1 MTT法检测细胞存活率

2.2 细胞生长抑制率

随着PTX-DGL和PTX-DGL-Gel的质量浓度增加，细胞抑制率也逐渐升高，同浓度比较，PTX-DGL-Gel对细胞的抑制率明显大于PTX-DGL，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

图2 MTT法检测细胞生长抑制率

2.3 细胞摄取率

培养48 h可见hepG2细胞对PTX-DGL-Gel的摄取率显著高于PTX-DGL，差异有统计学意义(P<0.05)(见图3)。

3 讨 论

癌症是人类的第一杀手，目前对癌症最常用的内科治疗方法仍以化疗为主，化学药物在杀死肿瘤细胞的同时，也对正常的组织细胞产生很大的毒副作用，直接影响了患者的生理功能[7]。靶向给药系统可以使药物选择性地浓集于病变器官、组织或者细胞中，提高化疗药物的治疗效果，降低化疗的系统毒性，是抗癌药物新型制剂研究的方向[8]。目前用于靶向肝癌的用药途径主要有：第一，被动靶向[9-10]。利用癌症的病理和生理特点，透过肝组织中的Kupffer细胞摄取递药微粒而达到被动靶向的作用。第二，主动靶向。利用肝癌细胞中高表达的受体，如转铁蛋白受体[11]、低密度脂蛋白受体[12]等，通过与之相对应的配体修饰递药系统，利用配体受体之间的亲和力，达到主动靶向的作用。此外，树枝状高分子聚合物DGL具有易于修饰、载药能力高、生物可降解等优点[13]。DGL表面富含氨基，能够方便用于修饰药物和靶向分子，且其粒径仅有5 nm，有望具有良好的穿透性[14]。因此本研究拟采用DGL作为载体。PTX是临床一线抗肿瘤药物，但其有毒副作用大、肿瘤靶向性差的缺点[15]，因此本研究选择PTX作为模型药物，将其修饰于DGL表面，形成药物载体PTX-DGL。将药物载体用明胶纳米粒包裹而形成较大粒径(约200 nm)的纳米粒PTX-DGL-Gel，从而赋予该载体系统良好的肿瘤滞留能力和具有肿瘤微环境响应性的穿透能力[16]。抗生物素蛋白(Avidin)相对分子质量约为66 KDa，为高度糖基化的蛋白，含有很多碱性氨基酸，如赖氨酸和精氨酸，在通常情况下带正电荷，Avidin的N端含乙酰半乳糖氨和甘露糖残基，可以选择性地聚集于肝脏部位[17]，还可以靶向肝癌细胞[18]。研究表明[19]，腹腔注射Avidin，可以选择性地浓集于肝脏组织。本研究中，选择Avidin作为靶向头基修饰递药系统，实现肝癌的靶向给药。该研究采用化学偶联法合成PTX-DGL和PTX-DGL-Gel，紫外可见吸收光谱法对合成载体材料进行表征。色谱分析技术证实，DGL-Gel对PTX的测定无干扰。体外溶血试验说明，在质量浓度为5，10，15，20，25 mg/mL时，hepG2细胞对PTX-DGL和PTX-DGL-Gel均有较好的生物相容性，随着PTX-DGL和PTX-DGL-Gel的质量浓度增加，细胞抑制率逐渐升高，同浓度比较，PTX-DGL-Gel对细胞的抑制率明显大于PTX-DGL(P<0.05)。提示，PTX-DGL-Gel对肿瘤细胞的靶向杀伤作用明显提高。培养48 h可见hepG2细胞对PTX-DGL-Gel的摄取率显著高于PTX-DGL(P<0.05)。提示，细胞对PTX-DGL-Gel的靶向摄取效率明显提高，体现了可控纳米递药系统对肿瘤细胞杀伤作用的主要特性[20]。

图3 荧光标记细胞药物的摄取率

综上所述，可控纳米递药系统PTX-DGL-Gel与肝癌细胞hepG2有较好的生物相容性，对细胞抑制率和摄取率明显提高，增强了药物的靶向疗效。本研究根据肝癌的生理特点，利用肿瘤部位微环境，设计了能够同时选择性靶向肝癌细胞且具有良好肿瘤穿透性的可收缩纳米递药系统PTX-DGL-Gel。该策略为肝癌的靶向诊断和治疗提供了新思路，有望进一步提高对肝癌的治疗效果，具有重要的研究价值和潜在的应用意义。