术前联合使用顺铂和中药大黄素对人食管鳞癌WIG-1 mRNA的影响

肖仁斌

湘雅萍矿合作医院肿瘤科，江西萍乡 337000

在20世纪中期食管癌是一种不常见的癌症，但自20世纪70年代以来，食管下段和胃食管交界处腺癌的发病率呈现稳步上升的趋势。食管癌（主要是鳞状细胞癌）在世界部分地区，尤其是东亚地区广泛流行，该病在早期没有典型的临床症状，因此大多数患者在发现患有该疾病时已经是中晚期[1-2]。根据全世界癌症病例的统计数据表明，食管癌的发病率和致死率在全世界全部癌症发生率和致死率中分别排在第7 位和第6 位，且在我国该病的发生率和致死率是最高的[3]。当前为延长该类疾病患者的存活时间，临床上通常采用手术切除、放化疗、靶向治疗以及免疫疗法的联合治疗方案[4-5]。临床相关实验数据表明，在对患者进行切除手术前进行化疗可延长患者的生存时间，并提高其生活质量[6]。顺铂是一种由氯原子和氨分子结合而形成的络合物，可以有效抑制DNA 的复制阶段，进而抑制癌细胞的生长，具有较好的抗癌作用[7]。而大黄素是中药大黄、虎杖的主要活性成分，是一种蒽醌类衍生物，在临床上具有抑制免疫活性、抑制癌细胞生长以及抗炎的功效，且其作为治疗癌症的药物具有低毒性的较大优势，因此被医护工作者广泛关注[8-9]。相关研究表明，野生型p53基因是一种抑癌因子，其野生型p53 诱导基因1（wildtype p53-induced gene，WIG-1）可与癌细胞结合，进而抑制肿瘤的生长[10]。本研究旨在分析术前联合应用西药顺铂和中药大黄素对人食管鳞癌WIG-1 mRNA的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取在湘雅萍矿合作医院2019年1月—2020年8月接受治疗的120 例食管癌鳞癌患者作为研究对象，所有患者均采用西药顺铂和中药大黄素联合用药的方式进行为期3 个疗程的治疗。根据术中所取病灶组织部位的不同，将其分为观察组和对照组。观察组术中取肿瘤病灶组织，对照组术中取距离肿瘤部位3 cm 以上的癌旁组织，每组各60 例。对照组患者中，男26 例，女34 例；年龄26～83 岁，平均（55.30±7.46）岁；肿瘤直径1～9 cm，平均（4.49±0.85）cm；肿瘤生长部位，上段25 例，中段19 例，下段16 例；临床分期：Ⅱ期19 例，Ⅲ期23 例，Ⅳ期18 例。观察组患者中，男31例，女29 例；年龄25～84 岁，平均（57.30±8.86）岁，肿瘤直径1～9 cm，平均（4.63±0.69）cm；肿瘤生长部位：上段22 例，中段20 例，下段18 例；临床分期：Ⅱ期19 例，Ⅲ期22 例，Ⅳ期19 例。两组的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经湘雅萍矿合作医院医学伦理委员会审批通过。

纳入标准：①均符合人食管鳞癌的临床诊断要求，入院后经过病理检查确诊为食管鳞癌；②经体检患者符合进行手术治疗的标准，且在进行手术前联合服用大黄素和顺铂无较大不良反应，具有较好的耐受性；③患者及其家属享有知情权，依从性较好，可以服从医护人员的安排，完成相关检查。

排除标准：①有严重肝、肾等基础重大疾病患者；②有家族遗传史、精神异常的患者；③入院时肿瘤已发生扩散和转移的患者。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

无菌操作台，恒温培养箱，4℃离心机（离心半径15 cm），实时荧光定量分析仪，电泳仪、精密电子分析天平、pH 剂、恒温加热水浴锅、高分辨光学显微镜、酶标仪（Sartorius，USA）。

1.2.2 试剂

RNA 提取试剂盒，CYBR-GREEN 荧光剂，DEPC水、TaqDNA 链式反应聚合酶（Thermofisher，Japan），TOX 酶、琼脂糖、牛血清白蛋白，免疫组化试剂盒等（Sigma，USA）。

1.3 方法

所有患者在确诊后，均接受大黄素（Sigma，货号：E7881）联合顺铂（山东齐鲁制药，生产批号：006013CF）的术前治疗方案。

1.3.1 配制大黄素溶液

称取大黄素数十克，充分溶解于二甲基亚砜中，并用配套滤膜进行无菌滤过，最终母液浓度为5 mg/mL，于-20℃冰箱中冷冻保存。进行试验时，将母液稀释为30 μg/mL 以及60 μg/mL[11-12]。

1.3.2 病灶样本采集

在3 个疗程结束后对患者进行手术治疗，在手术中取出患者的病灶组织和癌旁组织，溶于灭菌生理盐水中，于-20℃冰箱中冷冻保存。进行试验时用培养基将其稀释为5 μg/mL 以及10 μg/mL[13]。

1.3.3 WIG-1 mRNA的表达

1.3.3.1 mRNA 提取 ①裂解液配制：巯基乙醇按体积比100∶1 进行配制；②70%乙醇配制；③将待测样本用37℃PBS 冲洗后，加入配制好的裂解液，涡旋使其充分溶解至液体澄清透明；④将全部液体转移至蓝色过滤柱，15 000g，离心2 min；⑤弃去蓝色过滤柱，在滤液中加入等量70%乙醇，搅拌均匀；⑥转移至红色过滤柱中，15 000g，离心15 s；⑦弃去滤液，加入Wash Solution 1，500 μL，15 000g，离心15 s；⑧弃去滤液，加入Wash Solution 2，500 μL，15 000g，离心15 s；⑨将过滤柱转移至新管中，加入洗脱液50 μL，15 000g，离心1 min；⑩应用酶标仪在260/280 nm 处对提取的mRNA 浓度及纯度进行测量。

1.3.3.2 cDNA 合成 利用TaqDNA 合成酶对提取的mRNA 进行反转录。

1.3.3.3 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）测定 采用相对定量法对WIG-1 进行测定。内标基因为GAPDH，正向引物为5′-AGTGGGAAATCGCCTGTG-3′，反向引物为5′-CAGGGTACATTCGTGGTGC-3′。目标基因WIG-1 正向引物为5′-CCAACTGTCTCCTCAGACCC-3′，反向引物为5′-CCTGGGCATCTATACAGTCC-3′。总反应体系为10 μL，反应条件为：25℃，10 min；45℃，30 min；98℃，5 min。连续循环60 次。

1.4 观察指标

通过RT-PCR 测定结果比较两组WIG-1 mRNA表达水平，并记录观察组手术前后食管鳞癌组织和癌旁组织中WIG-1 mRNA的表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组WIG-1 mRNA 表达水平的比较

观察组肿瘤组织的WIG-1 mRNA 表达水平为（0.79±0.14），高于对照组的（0.06±0.02），差异有统计学意义（t=24.379，P<0.05）。

2.2 观察组手术前后肿瘤组织WIG-1 mRNA 表达水平的比较

观察组患者在接受手术后肿瘤组织的WIG-1 mRNA 表达水平为（0.24±0.04），低于术前的（0.79±0.14），差异有统计学意义（t=12.150，P<0.05）。

3 讨论

目前顺铂是用于治疗癌症较为常用的化疗药物之一，其可以较为有效地抑制肿瘤细胞的生长。临床数据表明，顺铂用于治疗人食管鳞癌的作用机制是通过诱导p53 和p73 两种细胞的凋亡通路进而抑制肿瘤细胞的增殖[14-15]。但其也具有较大的不良反应，随着用药时间的延长，患者逐渐出现恶心、呕吐等副作用，使其依从性减弱。因此联合用药成为目前治疗的主流手段[16-17]。

大黄素是从中药大黄等植物中提取的活性成分，可以有效清除体内自由基，进而发挥抗肿瘤的功效。相关临床研究数据显示，大黄素可以调节多种通路，进而达到抗肿瘤的效果[18]。本研究旨在分析联合应用西药顺铂和中药大黄素对人食管鳞癌WIG-1 mRNA的影响，结果显示，观察组肿瘤组织的WIG-1 mRNA表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。且观察组患者在接受手术后肿瘤组织的WIG-1 mRNA表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。提示术前联合使用顺铂和大黄素可降低人食管鳞癌WIG-1 mRNA的表达水平。

综上所述，WIG-1 mRNA 基因在未发病组织中表达量较少，且在术前联用西药顺铂和中药大黄素对食管鳞癌患者进行治疗有利于减少WIG-1 mRNA 基因的表达量，可较好地改善患者的预后，进而为食管鳞癌的治疗提供临床及分子学依据。