抗抑郁新药-参味宁郁片对大鼠慢性应激模型及小鼠悬尾模型的抗抑郁作用研究

王雅欣 郭姗姗 高英杰 图娅 崔晓兰

摘要 目的：研究抗抑郁症中药新药-参味宁郁片对慢性应激抑郁模型大鼠及小鼠悬尾抑郁模型的抗抑郁作用。方法：大鼠慢性应激模型：除正常组外，其余各组给予相应的慢性应激，并在造模前1 h灌胃给药，共持续21 d。实验前后通过体质量变化、糖水实验、自发活动开场实验测试，观察各组大鼠相应指标的评分变化。采用放射免疫测定法检测相关激素水平。小鼠悬尾抑郁模型：连续给药7 d后用小鼠自主活动记录仪记录活动次数，再将小鼠悬尾后记录小鼠不动时间，探究各给药组对小鼠悬尾不动时间的影响。结果：慢性应激抑郁模型：在造模21 d后，与正常组比较，模型组大鼠在体质量、糖水偏好指数、水平及垂直运动评分等方面均显著降低（P<0.05），参味宁郁片低剂量组在糖水实验、水平及垂直运动评分与模型组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。此外，参味宁郁片3个剂量组均可有效降低慢性应激模型大鼠CRF的含量，低剂量组可显著降低模型大鼠的ACTH水平（P<0.05）。小鼠悬尾抑郁模型：各给药组小鼠悬尾后的不动时间与模型组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论：抗抑郁癥中药新药-参味宁郁片对慢性应激抑郁模型及小鼠悬尾抑郁模型均具有一定的抗抑郁作用。

关键词 抑郁症;大鼠慢性应激模型;小鼠悬尾模型;自发活动开场实验;糖水偏好;放射免疫测定;参味宁郁片

Abstract Objective：To investigate the antidepressant effect of Shenwei Ningyu Pills，a new anti-depression Chinese medicial，on the chronic stress depression model with rat and mouse tails suspended.Methods：Chronic Stress Model in Rats：except for the normal control group，rats in other groups were given the corresponding chronic stress，and given by gavage 1 h before modeling，for a total of 21 d.The changes of each index before and after the experiment were observed through body weight change，sugar water test and open field test.The levels of related hormones were detected by radioimmunoassay.Mouse suspended tail depression model：After continuous administration for seven days，the activity times were recorded with the mouse automatic activity recorder，and then the mouse fixed time was recorded after tail suspension，to explore the effects of each administration group on the suspended tail fixed time of mice.Results：Chronic stress depression model：Twenty-one days after modeling，compared with the normal group，rats in the model group exhibited significantly reduced body weight，sucrose preference index，and horizontal and vertical motor scores （P<0.05）.Compared with the model group，the low-dose Shenwei Ningyu Pills group had significant differences in the sugar water test，horizontal and vertical movement scores （Ps<0.05）.In addition，all three dose groups of Shenwei Ningyu Pills could effectively reduce the content of CRF in chronic stress model rats，and the low dose group could significantly reduce the ACTH level in model rats （P<0.05）.Mouse suspended tail depression model：The immobility time after tail suspension in each administration group was significantly different from that in the model group （Ps<0.05）.Conclusion：Shenwei Ningyu Pills，a new anti-depression Chinese medicinal，has a certain anti-depression effect on both the chronic stress depression model and the mouse suspended tail depression model.

Keywords Depression; Chronic Stress Model in Rats; Mouse suspended tail model; Open field experiment;Sugar water preference; Radioimmunoassay; Shenweiningyu Pills

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.011

抑郁症是一种临床表现多样的精神类疾病，以显著且持续性情绪低落为主要症状[1]，又称为抑郁障碍，是一种高患病率、高致残率和高病死率的常见精神疾病[2-3]，并伴有认知、行为和社会功能异常等，严重者会有自杀倾向[4]。全球有近19%的人患有抑郁症，其中约有3亿人患有重度抑郁症[5]，重度抑郁症将会严重降低患者生命质量，带来极大的经济负担[6]。2008年，WHO将重度抑郁症列为全球疾病负担的第三大原因[7]。抑郁症也是多种疾病的并发症之一，如产后抑郁症、糖尿病抑郁综合征、脑卒中抑郁症等相关疾病。

抑郁症的发病机制较为复杂，目前针对抑郁症的诊断主要以临床表现为主，国内外对于抑郁症生物标志物的研究主要集中于炎症介质、神经营养因子、下丘脑-垂体-肾上腺激素（HPA）轴等方面[8]，本实验证实了中药抗抑郁新药-参味宁郁片能够使慢性应激抑郁模型大鼠及悬尾抑郁模型小鼠的行为学得到改善，并且能够降低抑郁模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴中关键因子的含量水平，以期对中药临床抗抑郁研究提供更多实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 本实验纳入成年雄性SD大鼠60只，6周龄，体质量160～180 g;昆明种小鼠雄性60只，3～4周龄，体质量13～15 g。实验动物由北京维通利华公司实验动物中心提供[合格证号：scxk（京）2002-0003]。动物自由摄食饮水，光照控制实验室昼夜交替，室温18～26 ℃，湿度（55±2）%。本实验获得中国中医科学院中药研究所实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 药物 1）受试药物：参味宁郁片（实验采用压片前的药粉），含7.0 g生药/g药粉，性状：浅棕色粉末，由中国中医研究院中藥研究所剂型室提供，批号：030802。2）阳性对照：百忧解，英国礼来公司产品，批号（98）卫药准字J-23号。临床适应证：抑郁症。剂型：胶囊。用法用量：20～40 mg/d。

1.1.3 试剂与仪器 促肾上腺皮质激素释放激素放射免疫检测试剂盒（批号：131116）、促肾上腺皮质激素放射免疫检测试剂盒（批号：131118）、肾上腺皮质激素放射免疫检测试剂盒（批号：131119）均购自北京华英生物技术诊断试剂公司。高速水平震荡仪（上海中生生物科技有限公司，型号：HY-4）;生理记录系统（成都仪器厂，型号：Rm6240B/C）;小鼠观察箱（24 cm×15 cm×15 cm，自制）;小鼠悬尾平衡支架（自制）;16管放射免疫γ计数器（众成机电技术公司，型号：DFM-96）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将实验动物进行适应性喂养，并在实验前用自发活动开场实验（Open-Field）对所有动物进行评分筛选。采用随机数字表法将大鼠及小鼠分为正常组、模型对照组、百优解组、参味宁郁片高剂量、中剂量组和低剂量组，每组10只。本实验中所有操作均遵循NIH及北京市实验动物伦理委员会的规定。1）大鼠慢性应激抑郁模型：正常组和模型组给予生理盐水，其余各给药组于每天实验前1 h按1 mL/100 g灌胃给药，1次/d。给药1 h后，除正常组外，其余各组给予相应的慢性应激。包括：高速水平震荡45 min;强迫游泳（15 ℃）5 min;足底电击3 min（36 V，时程5 s，间隔5 s/次）;夹尾（距尾根1 cm）3 min;禁水24 h;禁食24 h;温箱5 min（45 ℃）;昼夜颠倒24 h。每天选择1种进行1次，连续21 d，平均每种刺激1～3次。见表1。2）小鼠悬尾抑郁模型：在“行为绝望”动物抑郁模型中最突出的是小鼠悬尾模型。悬尾的小鼠为克服不正常的体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性不动，显示“失望”状态，这种状态被称为“行为绝望”。各组实验动物测定完自主活动后，立即用黏膏条将小鼠尾在距尾尖2 cm粘在一侧悬棒的下端，另一侧悬挂砝码，调整两侧平衡，记录时支架的动物端悬线穿过50 g张力换能器，用支架上的游标使动物端加重5 g再重新调平衡（作为前负荷），换能器连接到具有Rm6240B/C生理实验系统的电脑上。按该系统指示适应1 min后记录5 min的结果，将不动时间段所包括的格数（个）换算成时间（s）。

1.2.2 给药方法 1）剂量设计。参味宁郁片：人临床用量为34 g生药/（60 kg·d），即0.57 g/（kg·d），换算成小鼠用量即为3、6、12 g生药/（kg·d），大鼠用量即为1.5、3、6 g生药/（kg·d），均分别相当于人临床用量的1/2倍、等倍和2倍。百忧解：临床人用量为40 mg/（60 kg·d），实验时小鼠用量为5.2 mg/（kg·d）;大鼠用量为2.6 mg/（kg·d）;均为临床等效用药量。2）给药方式：小鼠按0.2 mL/10 g灌胃给药;大鼠按1 mL/100 g灌胃给药。

1.2.3 大鼠慢性应激抑郁模型检测指标与方法

1.2.3.1 行为学观察 1）体质量测量：本实验分别于开始前1天（0 day）、第21天（21 days）对大鼠进行体质量监测，比较不同时间点各组大鼠体质量变化情况。2）糖水偏好实验：在实验开始前，先训练所有大鼠使其适应含1%蔗糖水。分别于实验开始前1天、第7天、第14天和第21天进行糖水实验，再计算大鼠的糖水偏好指数，比较分析各组大鼠在不同时间点糖水偏好指数的差异[9]。糖水偏好指数公式=（糖水消耗/总液体消耗）×100%。3）自发活动开场实验：本实验所用的自发活动开场实验箱为高40 cm，长、宽均为80 cm的箱体，周壁、底面为黑色，底面由面积相等的25块组成，用白线划分。将大鼠置于敞箱底面的中心方格内以动物穿越底面的格数（四爪均进入的方格方可记数）为水平运动得分;以后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁）为垂直运动得分。每只动物测定1次，测定时间为3 min/次。分别于实验开始前1天（0 day）和第21天（21 days）进行测试，比较分析各组大鼠在不同时间点自发活动开场实验测试的水平穿越格数和垂直竖立次数的差异。

1.2.3.2 指标检测 1）取材方法：待各组实验动物存活期满后，于第22天经10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，断头取脑，取出下丘脑、垂体、肾上腺分别称重。2）测定方法：通过放免法测定下丘脑中促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）、垂体中促肾上腺皮质激素（ACTH）、肾上腺中皮质醇（CORT）的含量。

1.2.4 小鼠悬尾抑郁模型检测指标与方法

行为学观察。实验前1周将小鼠分笼饲养，室温（20±1）℃，自由饮食。各给药组灌胃给药，正常及模型组给予等体积生理盐水，1次/d，连续7 d，第7天给药后1 h，将单只小鼠放入小鼠自主活动记录仪，适应1 min后，记录5 min内的活动次数，作为自主活动的指标，随后立即用粘膏条将小鼠尾在距尾尖2 cm粘在一侧悬棒的下端，另一侧悬挂砝码，调整两侧平衡，记录时支架的动物端悬线穿过50 g张力换能器，用支架上的游标使动物端加重5 g再重新调平衡（作为前负荷），换能器连接到具有Rm6240B/C生理实验系统的电脑上。按该系统指示适应1 min后记录5 min的结果，将不动时间段所包括的格数（个）换算成时间（s）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，实验结果均以平均值±标准误（±s）表示。对数据进行正态性检验，方差齐用t检验;方差不齐，用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠慢性应激抑郁模型

2.1.1 行为学实验结果 ;1）体质量测量：造模前各组大鼠体质量无显著差异。造模21 d后，模型组体质量显著低于正常组（P<0.05）;参味宁郁片高、中剂量组与正常组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。2）糖水实验：正常组糖水摄入量随时间的增加呈逐渐上升趋势;模型组的糖水摄入量从造模第7天开始，显著低于正常组，造模21 d后仍保持在低水平状态，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.05）;参味宁郁片低剂量组的糖水摄入量随时间的增加呈逐漸上升趋势，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。3）自发活动开场实验：造模前，各组大鼠自发活动开场实验的水平运动和垂直运动得分差异无统学意义。在造模21 d后，模型组的水平运动得分显著低于正常组（P<0.05），参味宁郁片高剂量组、中剂量组的水平运动得分高于模型组，但差异无统计学意义，低剂量组的水平运动得分显著高于模型组（P<0.05）。模型组自发活动开场实验的垂直运动得分显著低于正常组（P<0.05），参味宁郁片高剂量组、中剂量组的垂直运动得分高于模型组，但差异无统计学意义，低剂量组的垂直运动得分显著高于模型组（P<0.05）。见表4。

2.1.2 指标检测结果 与正常组比较，慢性应激模型大鼠的促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）、促肾上腺皮质激素（ACTH）及皮质醇（CORT）均有明显升高，且CORT与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01）。参味宁郁片3个剂量组均可有效降低慢性应激模型大鼠CRF的含量，与阳性药百忧解相比效果更好，本药低剂量组可显著降低模型大鼠的ACTH水平（P<0.05）。见表5。

2.2 小鼠悬尾抑郁模型 参味宁郁片各剂量组对小鼠自主活动并无明显影响。各给药组小鼠在悬尾后的不动时间与模型组比较均有明显缩短，且与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表6。

3 讨论

近年来，全球范围内抑郁症的患病概率持续上升，且自杀率显著增加[10]，已经严重危害到人类健康及世界经济的发展[11]。因此针对抑郁症的研究从未止步，并且研发出诸多与人类抑郁症发病机制相似的动物抑郁症模型[12]，只有在可靠的动物模型上才能探索更多治疗抑郁症的特效药。

本研究中涉及的2种动物抑郁模型均为经典且常见的抑郁模型。小鼠悬尾抑郁模型属于典型的“行为绝望”模型，是由研究者Steru等[13]于1985年提出，属于一种温和刺激致抑郁模型。慢性应激抑郁模型因其对动物身体伤害较小且多种刺激方式随机出现可克服动物的适应反应而深受研究者们的青睐[14]，快感缺乏是抑郁症患者的基本症状之一，该模型通过测量实验动物消耗的糖水量来验证是否造模成功[15]。而抗抑郁药可以增加该抑郁模型的糖水摄入量。

有研究证实抑郁症的神经内分泌系统的功能改变主要以下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能亢进为主[16]，具体表现为：促肾上腺皮质素释放激素水平升高、促肾上腺皮质激素分泌增强、皮质醇水平增高，昼夜分泌节律改变等[17]。HPA轴可分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（CORT）等，这些指标的水平变化通常作为应激程度的指标[18]。樊蔚虹等[19]研究发现慢性束缚大鼠血浆中ACTH、血清CORT含量水平明显升高，大鼠海马损伤对HPA轴负反馈调节作用减弱，HPA轴功能产生亢进，用药干预后可明显降低大鼠血浆ACTH、血清CORT水平，对HPA轴功能亢进也具有显著调节作用。

本研究所用药物为中药抗抑郁新药-参味宁郁片，该药在2005年作为国内首个准入临床试验的治疗抑郁症的纯中药小复方制剂（6.1类）获得CFDA临床研究批件。临床试验证实该药对于气阴两虚型抑郁症有显著疗效，且具有较好的安全性和有效性[20]。参味宁郁片还能够显著逆转慢性束缚应激诱导海马中TLR4、MyD88蛋白上调表达水平，并且可对以模式识别受体TLR4信号通路介导的免疫炎性激活进行广泛调节[21]。

本实验采用2种经典的抑郁症动物模型，证实了参味宁郁片能够明显改善慢性应激模型大鼠的糖水偏好指数、水平及垂直运动评分，并且可有效降低该模型大鼠CRF、ACTH及CORT的含量。在小鼠悬尾抑郁模型上该药能够显著缩短悬尾后的不动时间。充分证实了抗抑郁症中药新药-参味宁郁片对慢性应激大鼠抑郁模型及小鼠悬尾抑郁模型均具有一定的治疗作用，以期为今后抑郁症的临床研究提供一定的实验依据[22]。

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（2021-04-12收稿 责任編辑：王明）