牛蒡子苷元对阿尔茨海默病体外模型细胞凋亡和氧化损伤的影响

柯来顺 涂燕芬 林庆金 刘华斌 肖雪莲

摘要 目的：探討牛蒡子苷元对阿尔茨海默病体外模型β淀粉样肽25-35（Aβ25-35）诱导PC12细胞凋亡和氧化损伤的影响及机制。方法：将PC12细胞分成对照组、模型组（Aβ25-35处理）、ATG-L组（2 μmol/L牛蒡子苷元和Aβ25-35处理）、ATG-M组（4 μmol/L牛蒡子苷元和Aβ25-35处理）、ATG-H组（8 μmol/L牛蒡子苷元和Aβ25-35处理）、ATG-H+LY29400组（AKT信号抑制剂LY29400、8 μmol/L牛蒡子苷元和Aβ25-35处理）。以流式细胞术检测细胞凋亡变化，黄嘌呤氧化法检测超氧化物歧化酶（SOD）含量，Western Blotting法检测磷酸化的蛋白激酶B（p-AKT）蛋白表达。结果：ATG-L组、ATG-M组、ATG-H组p-AKT/AKT表达量以及SOD含量高于模型组，差异均有统计学意义（均P<0.05）;ATG-L组、ATG-M组、ATG-H组细胞凋亡率低于模型组，差异均有统计学意义（均P<0.05）;ATG-H+LY29400组p-AKT/AKT表达量以及SOD含量低于ATG-H组，差异均有统计学意义（均P<0.05）;ATG-H+LY29400组细胞凋亡率高于ATG-H组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论：牛蒡子苷元通过激活AKT信号通路抑制阿尔茨海默病体外模型Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡和氧化损伤。

关键词 牛蒡子苷元;PC12细胞;阿尔茨海默病;β淀粉样肽25-35;AKT信号;凋亡;氧化损伤;增殖

Abstract Objective：To investigate the effect and its mechanis of arctigenin on the apoptosis and oxidative damage of PC12 cells induced by amyloid beta 25-35（Aβ25-35）in an in vitro model of Alzheimer′s disease.Methods：PC12 cells were divided into a control group，a model group （Aβ25-35 treatment），a ATG-L group （2 μmol/L arctigenin and Aβ25-35 treatment），a ATG-M group （4 μmol/L arctigenin and Aβ25-35 treatment），a ATG-H group （8 μmol/L arctigenin and Aβ25-35 treatment），and a ATG-H+LY29400 group （AKT signal inhibitor LY29400，8 μmol/L arctigenin and Aβ25-35 treatment）.Flow cytometry was used to detect cell apoptosis changes.Xanthine oxidation method was used to detect superoxide dismutase （SOD） content.The expression of Phosphorylated protein kinase B （p-AKT） protein in cells was detected with Western Blotting method.Results：P-AKT/AKT expression and SOD content in the ATG-L，ATG-M，ATG-H group were higher than those in the Model group，and the differences were statistically significant （Ps<0.05）; The apoptosis rate of the ATG-L，ATG-M，ATG-H group were lower than those of the Model group，and the difference was statistically significant （Ps<0.05）; The p-AKT/AKT，SOD levels in the ATG-H+LY29400 group were lower than those in the ATG-L，ATG-M and ATG-H group，and the differences were statistically significant （Ps<0.05）; The apoptosis rate in the ATG-H+LY29400 group were higher than those in the ATG-H group，and the differences were statistically significant （Ps<0.05）.Conclusion：Arctigenin can inhibit the apoptosis and oxidative damage of PC12 cells induced by Aβ25-35 in an in vitro model of Alzheimer′s disease by activating the AKT signaling pathway.

Keywords Arctigenin; PC12 cells; Alzheimer′s disease; Aβ25-35; AKT signal; Apoptosis; Oxidative damage; Proliferation

中图分类号：R285;R745.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.010

阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病，也是常见的老年疾病之一，对于阿尔茨海默病发病机制，有氧化应激学说、瀑布假说、胆碱能学说、瀑布假说等多种学说[1]。β淀粉样肽（Amyloid Beta，Aβ）沉积诱导神经细胞损伤，促进神经功能障碍[2]。牛蒡子苷元是从中药牛蒡子中提取出来的活性成分，具有抗炎、抗病毒、调节免疫等作用，对肿瘤、糖尿病等有治疗功效[3-4]。有研究发现，牛蒡子苷元可改善神经功能，牛蒡子苷元处理可改善乙醇诱导的PC12细胞损伤，减少细胞凋亡[5]。牛蒡子苷元治疗后的阿尔茨海默病小鼠模型记忆功能明显改善，衰老斑块减少[6]。目前尚未发现牛蒡子苷元在阿尔茨海默病体外PC12细胞模型中的作用研究。已经有研究表明，牛蒡子苷元发挥作用与信号通路如AKT等有关。AKT信号在组织中广泛表达，具有调控细胞生长、凋亡、自噬、炎症、氧化平衡等作用[7-8]。有研究显示，阿尔茨海默病中AKT信号通路激活水平降低，而激活AKT可改善神经损伤[9]。本实验以Aβ25-35诱导PC12细胞，体外构建阿尔茨海默病细胞模型，探讨牛蒡子苷元对阿尔茨海默病细胞模型凋亡和氧化损伤的影响及机制，为牛蒡子苷元治疗阿尔茨海默病的临床使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 PC12细胞，货号iCell-r026，由赛百慷（上海）生物技术股份有限公司提供。

1.1.2 药物 牛蒡子苷元，规格：100 mg，批号：D297801，纯度：≥98.0%，国家标准物质资源平台生产。

1.1.3 试剂与仪器 AKT抗体（Abcam公司，美国，货号：ab8805），Bax抗体（Abcam公司，美国，货号：ab32503）;Bcl-2抗体（Santa Cruz Biotechnology公司，美国，货号：sc-7382），p-AKT抗体（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：9271），Aβ25-35（Sigma公司，美国，货号：A4559-250UG）;SOD检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：BC0170）;GSH-Px检测试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A005-1-2）;MDA检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，货号：S0131S）;AKT信号抑制剂LY29400（medchemexpress公司，美国，货号：LY29400），酶标仪（北京悦昌行科技有限公司，型号：SpectraMax iD5），流式细胞仪（贝克曼库尔特公司，美国，型号：CytoFLEX），倒置显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司，型号：XSP-11CD）。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药方法 PC12细胞分成对照组、模型组、ATG-L组、ATG-M组、ATG-H组、ATG-H+LY29400组，分组处理方法如下：1）对照组：按照常规方法培养;2）模型组：用含有20 μmol/L的Aβ25-35细胞培养液刺激;3）ATG-L组：用含有2 μmol/L的牛蒡子苷元和20 μmol/L的Aβ25-35细胞培养液处理;4）ATG-M组：用含有4 μmol/L的牛蒡子苷元和20 μmol/L的Aβ25-35细胞培养液处理;5）ATG-H组：用含有8 μmol/L的牛蒡子苷元和20 μmol/L的Aβ25-35细胞培养液处理;6）ATG-H+LY29400组：用含有10 μmol/L的AKT信号抑制剂LY29400、8 μmol/L的牛蒡子苷元和20 μmol/L的Aβ25-35细胞培养液处理。

1.2.2 检测指标与方法 1）CCK-8实验分析细胞增殖[10]：在96孔细胞培养板中接种PC12细胞，接种密度为每孔4 000个细胞/100 μL，细胞培养过夜以后，分别在细胞中添加牛蒡子苷元，使其终浓度为0、2、4、8、16、32 μmol/L，或按照1.2.1中方法分组，每组设置3个复孔，继续培养24 h，在孔内添加CCK-8，每个孔中添加10 μL，在37 ℃继续反应3 h。调整酶标仪波长为450 nm，检测每个孔的OD值。OD值表示细胞增殖活性。2）流式细胞术测定细胞凋亡[11]：对照组、模型组、ATG-L组、ATG-M组、ATG-H组、ATG-H+LY29400组细胞培养24 h以后，每组设置3个复孔，在细胞中加入PBS洗涤2次，然后添加Binding Buffer配制成单细胞悬浮液，吸取5 μL的PI和Annexin V-FITC添加到细胞内，放在室温条件下结合15 min。用流式细胞仪检测凋亡变化。3）Western Blotting方法检测Bax、Bcl-2、p-AKT蛋白表达[12]：对照组、模型组、ATG-L组、ATG-M组、ATG-H组、ATG-H+LY29400组细胞培养24 h以后，每个检测样品设置3个复孔，在细胞中加入PBS溶液洗涤2次，添加含PMSF的RIPA，在冰上充分裂解。转移至离心管中，4 ℃，10 000×g离心10 min。蛋白存在于上清液中。蛋白浓度测定用常规BCA方法，步骤根据试剂盒说明书进行。在蛋白样品中加入5×Loading Buffer，于100 ℃煮沸5 min。本实验选择10%分离胶、5%浓缩胶进行电泳。每个泳道内添加30 μg蛋白样品。首先以70 V的电压电泳，肉眼可见蓝色染料电泳到分离胶时，此时将电压调整为100 V，等到蓝色染料已经完全进入玻璃板底部边缘1 mm处，关闭电源。将凝胶取出，切下分离胶。根据蛋白分子量大小裁剪NC膜。在冰上，100 V电压条件下转膜2 h。NC膜放在封闭液中，转移到37 ℃条件下结合1 h。然后将NC膜放在一抗溶液中，Bax、Bcl-2一抗按照1∶800稀释，p-AKT一抗按照1∶600稀釋，AKT一抗按照1∶1 000稀释，在4 ℃过夜反应。把NC膜放在1∶2 000稀释以后的二抗中，转移到37 ℃环境中结合1 h。滴加ECL显色试剂。以GAPDH作为参照，根据条带的灰度值对目的蛋白表达量进行半定量分析，目的蛋白表达量=目的条带灰度值/内参GAPDH灰度值。4）SOD、GSH-Px、MDA含量检测[13]：对照组、模型组、ATG-L组、ATG-M组、ATG-H组、ATG-H+LY29400组细胞培养24 h以后，以SOD检测试剂盒（黄嘌呤氧化法）、GSH-Px检测试剂盒（比色）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件分析数据，计量数据用均数±标准差（±s）表示，数据均满足正态分布及方差齐性，2组比较用t检验，多组差异比较用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牛蒡子苷元对PC12细胞增殖影响 与0 μmol/L比较，2、4、8 μmol/L牛蒡子苷元处理后的PC12细胞增殖活性没有变化，而16、32 μmol/L牛蒡子苷元处理后的PC12细胞增殖活性降低。见表1。选择对PC12细胞增殖毒性无影响的2、4、8 μmol/L牛蒡子苷元做后续研究。

2.2 牛蒡子苷元对阿尔茨海默病PC12细胞增殖和凋亡的影响 模型组PC12细胞增殖活性降低，细胞凋亡率升高，细胞中Bax蛋白表达增多，Bcl-2蛋白表达减少，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。ATG-L组、ATG-M组、ATG-H组PC12细胞增殖活性逐渐升高，细胞凋亡率逐渐降低，细胞中Bax蛋白表达逐渐减少，Bcl-2蛋白表达逐渐增多，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1，表2。

2.3 牛蒡子苷元对阿尔茨海默病PC12细胞氧化损伤的影响 模型组PC12细胞SOD、GSH-Px含量降低，MDA含量升高，与对照组比较，差异均有统计学意义（均P<0.05）。ATG-L组、ATG-M组、ATG-H组PC12细胞的SOD、GSH-Px含量逐渐升高，MDA含量逐渐降低，与模型组比较，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见表3。

2.4 牛蒡子苷元对阿尔茨海默病PC12细胞中AKT信号通路的激活作用 模型组PC12细胞p-AKT/AKT表达量降低，与对照组比较，差异均有统计学意义（均P<0.05）。ATG-L组、ATG-M组、ATG-H组PC12细胞p-AKT/AKT表达量逐渐升高，与模型组比较，差异有统计学意义（均P<0.05）。见图2和表4。

2.5 AKT信号通路抑制剂对牛蒡子苷元作用阿尔茨海默病PC12细胞增殖、凋亡和氧化损伤的影响 ATG-H+LY29400组PC12细胞增殖活性降低，细胞凋亡率升高，细胞中Bax蛋白表达增多，Bcl-2蛋白表达减少，p-AKT/AKT表达量减少，SOD、GSH-Px含量降低，MDA含量升高，与ATG-H组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3，表5。

3 讨论

阿尔茨海默病占全部老年痴呆的60%以上，记忆减退、人格变性、认知障碍等是阿尔茨海默病的临床表现。Aβ沉积产生老年斑、神经元丢失是阿尔茨海默病的典型病理特征，Aβ可诱导神经细胞氧化损伤，促进细胞凋亡，造成神经功能障碍[2]。细胞内氧化应激平衡与抗氧化酶活性有关，GSH-Px、SOD是常见的抗氧化酶，其活性降低可以诱导氧自由基积累，诱导脂质发生过氧化，产生MDA，造成氧化损伤[14]。氧自由基还可以激活细胞凋亡途径，加快细胞凋亡[15]。Bax和Bcl-2是Bcl-2蛋白家族成員，二者表达改变与细胞凋亡水平相关[16]。Bax在细胞凋亡过程中发挥促进作用，Bcl-2在细胞凋亡过程中发挥抑制作用，Bax和Bcl-2蛋白表达变化共同影响细胞凋亡[17]。本实验结果表明，Aβ25-35处理后的PC12细胞凋亡率升高，细胞中Bax蛋白表达增多，Bcl-2蛋白表达减少，细胞增殖活性下降，GSH-Px、SOD含量降低，MDA含量升高，Aβ25-35诱导PC12细胞损伤，提示成功构建了阿尔茨海默病体外细胞模型。

牛蒡子苷元是一种木脂素类化合物，可用于治疗麻疹、风热感冒，现代药理学还证明牛蒡子苷元具有降血糖、抗菌、抗肿瘤等功效[18]。有实验发现，牛蒡子苷元对阿尔茨海默病也具有改善功效，牛蒡子苷元治疗后的阿尔茨海默病小鼠神经记忆功能明显改善[6-7]。本实验结果显示，牛蒡子苷元处理后的阿尔茨海默病PC12细胞增殖活性升高，细胞凋亡减少，细胞中Bax蛋白表达减少，Bcl-2蛋白表达增多，GSH-Px、SOD含量升高，MDA含量降低，牛蒡子苷元改善阿尔茨海默病PC12细胞氧化损伤，减少细胞凋亡，我们首次在体外阿尔茨海默病细胞模型中证明了牛蒡子苷元的作用，并且说明牛蒡子苷元可能是阿尔茨海默病的治疗药物。

牛蒡子苷元的药理学作用广泛，但其分子作用机制尚不明确。研究表明，牛蒡子苷元可通过调控细胞内的信号通路发挥作用。牛蒡子苷元在改善阿尔茨海默病小鼠学习记忆障碍的同时可促进AKT磷酸化，牛蒡子苷元作用机制可能与AKT信号通路有关[7]。AKT是一个具有广泛作用的信号转导通路，参与细胞增殖、凋亡、分化、衰老、自噬等过程[19-21]。已知AKT信号在阿尔茨海默病中激活水平降低，而激活AKT信号可改善阿尔茨海默病进展[22]。本实验表明，牛蒡子苷元提高了阿尔茨海默病PC12细胞中p-AKT磷酸化水平，并且AKT信号抑制剂可逆转牛蒡子苷元对阿尔茨海默病PC12细胞增殖、凋亡和氧化损伤的作用，这进一步验证了牛蒡子苷元可通过激活AKT信号影响阿尔茨海默病PC12细胞损伤，首次发现牛蒡子苷元影响阿尔茨海默病体外细胞模型凋亡和氧化损伤的机制与AKT信号有关。

综上所述，牛蒡子苷元具有抗阿尔茨海默病作用，其可以通过激活AKT信号抑制阿尔茨海默病PC12细胞凋亡和氧化损伤，这为牛蒡子苷元治疗阿尔茨海默病的临床使用提供了理论支撑。以后实验中会继续分析牛蒡子苷元其他可能作用机制和具体分子靶向机制。

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（2021-09-01收稿 责任编辑：杨觉雄）