细菌性肝脓肿的实验室检查及病原体检测研究进展

张 威，陈国林

(哈尔滨医科大学附属第一医院 感染科，黑龙江 哈尔滨150001)

细菌性肝脓肿(Pyogenic liver abscess,PLA)在东亚地区是一种较常见的肝脏感染性疾病，死亡率达2-12%[1]。研究发现PLA在糖尿病、营养不良和免疫抑制等患者中发病率增加[2]。最近一项基于美国人口的研究显示[3]，在过去的35年中，PLA的发病率增加了2倍多，报道称发病率的增加归因于肝胆介入治疗频率增加和生物多药耐药性。虽然随着引流技术的发展和抗生素的广泛应用，PLA有了更好的预后，但如不及时诊断并给予合适的治疗，仍可发展为致命的结局，且该病并发症复杂，如并发内源性眼内炎虽经积极治疗仍不能获得满意效果。

由于大部分PLA的症状是感染引起的，是非特异性的，因此很难及时诊断，研究发现[4]，PLA患者主诉症状持续时间中位数为1周，另外1/4的患者在前1-2周就已经出现症状，还有一部分患者为体检发现。PLA的实验室检查结果也相对缺乏特异性[5]，但具有预测和提示意义。虽然实验室检查本身并不能诊断PLA，但实验室异常通常会促使进一步结合影像学等做出诊断。

PLA可根据致病菌分类,确定病原体可以一定程度上预测潜在的并发症，帮助早期识别并制定治疗方案[2]。不仅如此，针对病原体的治疗可避免不规范应用抗生素的情况，从而减缓耐药问题。研究发现[3]在过去的20年中，由多药耐药微生物引起的感染显著增加，比例从14%上升至51%。但由于PLA患者多数存在发热的症状，相当一部分在院外已经应用抗生素，这导致传统培养方法的阳性率减低，给病原体鉴定造成干扰，因此开展新技术鉴定PLA病原体是日后发展的趋势。伴随病原体的变迁及糖尿病和恶性肿瘤等免疫障碍患者的数量增加，PLA的病因、诊断和治疗发生了很大的变化。因此，PLA的临床诊疗面临着新的挑战。本文针对PLA的实验室检查及病原体检测的研究现状及进展展开综述。

1 实验室检查

PLA患者实验室检查较常见的异常是白细胞计数升高和感染诱发的血小板减少。肝功能异常常见低白蛋白血症、胆红素升高、转氨酶、碱性磷酸酶升高和γ谷氨酰转肽升高，炎症指标C反应蛋白(C-Reactive Protein,CRP)升高等等[4-7]。一项研究指出[7]最常见的实验室异常分别是98%和93.9%的病例中CRP和纤维蛋白原水平升高，其次是77%的患者白细胞结果异常，67%的患者碱性磷酸酶升高。并对他们之中34名患者给予降钙素原(PCT)检查，回报被检测患者的PCT水平均升高。白细胞计数的增加通常与PLA感染有关，但可能受到几种共存的非感染因素的影响，因此白细胞诊断能力较低。但研究表明[8]白细胞增加、血浆白蛋白减少与PLA脓肿的大小相关。研究指出[9]合并胆道疾病的PLA组的谷丙转氨酶、碱性磷酸酶和总胆红素水平高于无胆道疾病的PLA组，实验室检查也能辅助判断PLA的病因。

1.1 C反应蛋白

PLA患者的CRP几乎都存在不同程度的升高，研究认为[9]CRP在 PLA 中是反应炎症程度和评估抗感染治疗效果的一项简单有效和敏感的指标。研究显示[10]CRP正常后停用抗生素组和体温正常至少2周停用抗生素组经皮穿刺引流后抗生素治疗时间分别为15.83±6.45天和24.25±8.18天，CRP指导停药组用药天数明显少于体温指导停药组(P=0.001)。两组复发率均为0%，因此CRP值可作为决定经皮引流后的PLA抗生素治疗持续时间的独立因素。Law等研究表明[11]每周检测CRP有助于识别哪些PLA患者具有良好预后，并且能识别抗生素充分治疗疗程为5周或更短时间的患者。一项荟萃分析指出[12]，使用CRP指导的抗生素治疗与新生儿抗生素使用时长缩短相关。同样，基于CRP的算法也减少了成人门诊患者的抗生素使用。另外，研究认为血清CRP可能是鉴别肿块型肝内胆管细胞癌(IMCC)和PLA的潜在标志物。其他炎症指标包括白细胞总数、中性粒细胞绝对值/淋巴细胞绝对值(NLR)、Delta中性粒细胞指数(DNI)、血小板减少率和CRP在PLA组明显高于IMCC组。对两组而言，初始CRP值的曲线下面积显著高于初始血清白细胞计数、血小板减少率和DNI水平的曲线下面积(曲线下面积:0.909)。血清CRP(OR 1.290，95%CI 1.148-1.449，P<0.001)是区分PLA组和IMCC组的唯一显著预测因子[13]。不仅如此，基于人群的研究中发现PLA的几个不良预后因素，如年龄、恶性肿瘤、肾功能损害和败血症，与CRP水平较高相关[14-15]。

1.2 降钙素原

血清PCT是临床工作中细菌感染常见的生物标志物，对抗感染治疗也具有指导意义。研究中[9]，155名PLA患者中位PCT水平为3.14 ng/mL，95.5%(148/155)的PLA患者的PCT大于0.05 ng/mL。此外，4.5%(7/155)的患者的PCT检测结果正常。这是因为PCT的半衰期不长(20至24 h)，在局部细菌感染中通常是正常的或略有增加。此外研究还表明[16]，PLA并发脓毒血症组的平均PCT水平高于PLA不合并脓毒血症的亚组(P<0.001)；其他数据包括中性粒细胞计数和百分比显示两组间没有显著差异。血清PCT水平是原发性肝癌患者经肝动脉化疗栓塞治疗后诊断PLA合并脓毒症的指标，PCT的临界值为5.1 ng/mL，在预测PLA合并脓毒症中具有较高的特异性和敏感性。

1.3 Delta中性粒细胞指数

急诊入院时的高DNI指数水平是初始血流动力学稳定的PLA患者发生院内低血压的独立预测因子(OR:1.44，95%CI:1.06-1.95，P=0.02)。DNI大于3.3%与急诊入院发生院内低血压有关(OR:5.37，95%CI:2.91-9.92，P<0.001)[17]。最近的一项研究显示[18]，NLR与PLA患者的预后明显较差有关。但在预测住院低血压方面，急诊入院时的DNI的效能优于白细胞、中性粒细胞、CRP水平和NLR,DNI具有类似快速序贯器官功能衰竭评分(qSOFA评分)的作用[17]。未来需要对更多患者进行前瞻性多中心研究，以验证DNI在确定治疗充分性方面的有效性，及是否可作为对初始稳定的PLA患者进行紧急干预的时间点的标志。

2 病原体的变迁与检测

2.1 病原体的变迁

PLA在全球均有分布，各地的致病微生物谱各不相同。在西方一些国家，链球菌和大肠杆菌占主导位置。中国1项Meta分析显示[19]，在PLA中最常检出菌为大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，二者共计(83%)。大肠杆菌导致的PLA多为胆道源性且更易发生黄疸和脓毒症休克，多变量分析显示，大肠杆菌是一个独立死亡因素[20]。

近些年肺炎克雷伯菌肝脓肿(KPLA)的病例报告出现频次显著增加，现超越大肠杆菌，不仅仅是亚洲地区最主要的病原体，在欧洲发病率也有升高趋势。肺炎克雷伯氏菌有特定的毒力因子，因此被称为传播全球的高毒性菌株[1]。KPLA在糖尿病的患者中常出现，在一项亚洲研究中，KPLA的糖尿病患病率为61%，而除此之外其他PLA的糖尿病患病率为51.4%。可能因为血糖控制欠佳会影响嗜中性粒细胞对克雷伯氏菌K1/K2荚膜的吞噬作用，从而阻止对细菌的免疫反应[21]。最近美国安全网医院研究也表明[22]，最常见的PLA危险因素是糖尿病、既往肝脏手术和肝脏恶性肿瘤。其中有6名患者，糖尿病是他们唯一的危险因素。研究还发现产气性脓肿也和肺炎克雷伯菌感染相关，且死亡率高[23]。同时KPLA患者需要密切关注肝脏以外的侵入性表现，称为侵袭综合征，通常由高毒力肺炎克雷伯菌引起。最新研究发现[24]，毒力基因iutA在高毒力和普通肺炎克雷伯菌两组之间有显著差异(P=0.002),可以作为高毒力肺炎克雷伯菌的一个分子标志物。内源性眼内炎是KPLA侵袭综合征中一种毁灭性的并发症，部分患者经过外科及抗感染治疗仍不能恢复[25]。另外，在回顾性研究中发现大多数PLA的病例均是隐源性的[9，26]，这可能与肺炎克雷伯杆菌的流行相关。有人认为隐源性肝脓肿是隐匿性胃肠道恶性肿瘤的标志，1项荟萃分析给出的结论是隐源性PLA人群可考虑进行结肠镜筛查，尤其是KPLA的人群[27]。

还有一些特殊细菌可导致PLA，例如极少的布鲁菌氏病也可并发PLA，它与外科急腹症临床症状类似[28]。梭杆菌引起的PLA通常只发生在最近患有牙周病或咽炎的免疫活性宿主中[29]。PLA的病原体在地理上是多样的，不同国家之间存在差异，但由于全球人口的流动增加，病原体也随之变化。因此在鉴别诊断中，结合当地流行情况的同时，也必须越来越多地考虑以前不太频繁的病原体。

2.2 病原体的检测

病原体的及时检测不仅对明确的诊断治疗至关重要，而且对监测病情和感染控制也至关重要。在严重感染的患者中，病原体识别的延迟导致不及时和不适当的抗菌治疗，并最终导致更高的死亡率[30]。大约一半的肺炎克雷伯菌血症相关死亡发生在入院后的前72 h内[30]。然而，常规方法通常需要3-5天才能达到最终微生物学诊断[31]。虽然越来越多的病原体被报道出来，其中包括罕见的病原体，但对临床医生来说界定微生物病原体仍存在困难，实际工作中，许多患者在采集血或穿刺液标本前已经接受抗生素治疗，这种情况会导致病原检出率降低，阳性培养结果可能具有更高的耐药性，也可能低估了原有病原体的数量。但多数医院现仍以传统培养为主要手段，周期长且存在结果偏倚。目前二代测序(next-generation sequencing，NGS)等技术用于PLA的病原体的鉴定,有一定的临床价值，且具有精准、快速、广泛适用性、灵敏度高、可定量分析的优势[32-33]。

2.2.1血培养和浓汁培养 引起PLA的病原体种类繁多，目前的诊断主要依赖于病原体培养，但耗时、繁琐且容易出错。此外，常规培养方法的最大局限性之一是并非所有的病原体都适合培养，这可能是导致较低检出率的原因[32]。血液培养是诊断PLA的重要辅助手段，建议对任何疑似PLA的患者进行血液培养,即使获得阳性率更高的穿刺液标本，也不能忽略血培养的作用。脓汁和血液标本培养阳性率分别为81.3%(208/256)和25.2%(30/119)，导致这种结果的原因可能是多数感染局限在肝脏。值得注意的是，脓肿引流在最初放置导管时就应送检，随后可能被皮肤菌群感染，必要时血培养和浓汁培养均可重复，确保始终有针对的治疗[8]。

2.2.2二代测序技术 研究显示[32]NGS方法对细菌或真菌的检出率为95.0%(19/20)，按培养方法检测为60.0%(12/20)，相对于传统的培养，NGS具有明显优势(P=0.008)，尤其是在那些使用过抗生素的样本中更为明显。最近的1例病例报告[33]显示了NGS在PLA患者中的应用，NGS鉴定病原体为肺炎克雷伯菌以及变栖克雷伯菌，过程中临床医生有效利用NGS可定量分析的特点，动态定量监测血流中病原体负荷，根据NGS报告结果制定下一步增减抗生素的治疗方案，最终患者NGS仅能检测到少量的肺炎克雷伯菌，血培养回报阴性，好转出院。另一项研究表明[34]，16S核糖体RNA分析用于PLA培养阴性病例的子集，可将诊断率提高了13%，只有3/17(17.6%)样本呈阴性。现阶段，通过高通量测序可以靶向检测耐药基因的突变，对临床用药提供及时的指导意见，也对患者的预后情况提供了预估标准[35]。NGS不依赖病原体的分离培养，即便是微量病原体，传统培养回报阴性的情况下，运用NGS方法也可获得其基因信息，原理是检测过程中直接提取标本中全部核酸片段，获得数据包括病原体序列数、覆盖度等[32-33]。当然，该技术也存在弊端，未能区分活的或死的病原体是NGS技术的巨大局限性，需要加以考虑并迫切解决。由于这个原因，NGS作为一种半定量技术，某些情况下无法清楚地证明病原体与疾病进展之间的关系，从而影响临床治疗效果的判断[32]。

2.2.3纳米孔测序技术 Gong 等[36]使用纳米孔测序对PLA中的肺炎克雷伯菌菌株进行非培养依赖性分析。应用纳米孔测序技术鉴定引起PLA的病原体，由于细胞群受到高度污染，通过使用脱氧核糖核酸酶差速离心成功降低了人类脱氧核糖核酸的混杂效应。借助DNA 酶消化去除人源线性DNA，对处理后的样本进行 MinION 测序，生物信息分析，进行实时病原体鉴定，4 h内便识别出肺炎克雷伯菌2种亚型，并同时找出了emrB等多个耐药基因，极大地缩短了病原体鉴定的时间，为临床感染实时诊断与抗生素用药提供了重要参考。通过整合实时纳米孔测序和生物信息学软件，可以实现PLA病原体的快速检测，MinION单分子纳米孔测序仪将有望成为临床微生物诊断中一个颇有价值的补充工具。这项技术在超长读长、实时测序和便携性等方面的优势，使其在病原体检测方面的应用越来越广泛[37]。

尽管传统的血培养和浓汁培养灵敏度和可获得性有所限制，但仍应收集所有PLA患者的血培养，新的技术和方法作为传统方法的补充而非替代。由于耐多药微生物的不断出现和对抗它们的新药物的有限开发，已引起一场迫在眉睫的危机，尤其是对于革兰氏阴性菌。控制感染是我们目前的主要防御措施，未来应普及新技术的应用，提高病原体的检出率，如NGS等技术能够准确、快速地筛选出与病原体及其耐药性发展密切相关的多种基因靶点[32]，减少抗生素滥用及过度治疗，从而帮助减缓耐药引发的危机。

3 小结

PLA由于其全球各地病原学不同，疾病特点各异，给及时诊断带来挑战。实验室检查虽相对缺乏特异性，但有提示和预测意义，且贯穿诊疗始终，应加强重视。受抗生素使用不规范以及介入治疗频率的增加等因素影响，多药耐药微生物不断出现，造成一部分患者无药可治的局面。而且目前多数PLA患者仍仅应用传统培养方法进行病原体的鉴定，阳性率低且耗时较长，日后应着力于病原检测新技术的应用以及新药研发。目前PLA的研究中使用的抗生素种类繁多，为了消除这一混杂变量，需要更多来自控制抗生素使用的随机对照试验的数据。且许多数据来自单中心，这些规律是否能推广到其他地区和人种，相关问题值得深入探索。