高氧气调包装对宰后牛半膜肌成熟过程中品质的影响

2020-12-31扶庆权王海鸥陈全战王婷婷

食品科学 2020年23期

扶庆权，王海鸥，李坤，杨平，陈全战，王婷婷

（1.南京晓庄学院食品科学学院，江苏南京 211171；2.河北丰科生物科技有限公司，河北秦皇岛 066000）

高氧气调包装是底部采用一个聚乙烯塑料托盘，在包装盒内充入一定比例的混合气体（70%（体积分数，下同）～80% O2和20%～30% CO2或N2）置换包装盒内的空气，上面再采用具有气体阻隔性能的包装材料进行密封所制成的包装[1]。高氧气调包装能够抑制微生物的生长，有效延长产品货架期，还能较长时间能保持鲜肉颜色的稳定性，因此一些西方国家常选用高氧气调包装方式对鲜肉进行保鲜[2]。然而，高氧气调包装在贮藏期间由于氧气含量高加速了氧化过程，引起蛋白质氧化和脂肪氧化，而脂肪氧化由于氢过氧化物分解产生小分子酮类和醛类物质产生异味引起鲜肉酸败和肌红蛋白的氧化[3]；蛋白质氧化能够引起蛋白质的结构修饰并降低鲜肉的质构性质[4]，从而降低鲜肉的食用品质和营养价值[5-6]。

嫩度和颜色是评价牛肉宰后成熟过程中最重要的两个品质指标，其中颜色与氧气含量密切相关，也有研究指出鲜肉表面颜色和鲜肉的嫩度显著相关[7]。而嫩度与牛肉成熟过程中肌原纤维蛋白结构的完整性密切相关[8]，一些肌球蛋白、肌钙蛋白-T、肌腱线蛋白、伴肌动蛋白等关键结构蛋白的降解和破坏有利于改善牛肉的嫩度。研究表明，肌原纤维蛋白的降解是鲜肉嫩化的主要作用机制，但是肌原纤维蛋白的降解受到蛋白质氧化修饰的调节[9]。在牛肉冷藏成熟过程中，蛋白质氧化和脂肪氧化是调控牛肉产品品质的一个重要因素，尤其是不同包装方式下蛋白质氧化和脂肪氧化对牛肉的嫩度和颜色的改善起着非常重要的作用。

然而，高氧气调包装对宰后牛肉成熟过程中品质影响的内在机理目前还鲜有报道，本实验以东北‘西门塔尔’母黄牛为研究对象，从脂肪氧化、蛋白质氧化和蛋白降解的角度阐述其对牛肉品质影响的潜在机制，为生产企业科学使用不同包装提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料选取在东北养殖的‘西门塔尔’母黄牛（活体质量约260 kg，20 月龄）4 头，均在阜阳雨润食品有限公司按标准程序屠宰，经过去头、去皮、四肢和内脏等一系列工序后胴体于4 ℃冷库排酸24 h，排酸结束后取整块半膜肌备用。

肌钙蛋白-T单克隆抗体美国西格玛奥德里奇公司；羊抗兔免疫球蛋白抗体、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜美国密理博公司；牛血清白蛋白美国普洛麦格公司；电化学发光试剂盒美国赛默飞公司；2,4-二硝基苯肼上海阿拉丁试剂有限公司；兔血清、CY3羊抗兔免疫球蛋白武汉博士得生物工程有限公司；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）多克隆抗体英国Abcam公司；其他试剂均为分析纯或生化试剂。

1.2 仪器与设备

DC800型真空包装机美国快尔卫包装公司；S500高氧气调包装机西班牙屋玛公司；Avanti J-E型高速离心机美国贝克曼库尔特公司；Turrax T25型高速匀浆机德国艾卡公司；AUW120电子天平日本岛津仪器公司；TA-XT2i型质构仪英国Stable Micro Systems公司；CR-400型色差仪日本美能达公司；TW20型水浴锅德国优莱博公司；热电偶温度计美国Omega公司；Imagescanner凝胶成像仪美国GE公司；Spectra M2型酶标仪美国美谷分子仪器有限公司；LSM 700 META激光共聚焦显微镜德国Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

排酸后的牛半膜肌样品立即用不锈钢刀切成大小基本相同的长方形肉块（约500 g/块），每头牛肉随意取一定数量的肉块分别进行高氧气调包装（80% O2＋20% CO2）和真空包装，包装结束后放入4 ℃冰箱中贮藏成熟，在0、4、7、10 d时取样测定相关指标。

1.3.2 剪切力测定

剪切力的测定参考Lagerstedt等[10]的方法并进行适当的修改。牛半膜肌先切成大小一致的长方形肉块，将热电偶温度计插入肉块中间后置于蒸煮袋，放在75 ℃的水浴锅中蒸煮，当肉块的中心温度达到70 ℃时立即取出，用流动自来水进行冷却至室温。将样品沿着肌纤维方向切成1 cm×1 cm×6 cm大小的长方形肉条，使用质构仪垂直肌纤维方向测定其剪切力。测定条件：探头型号HDP/BS，触发力50 g，测定前、后速率5 mm/s，测定速率2 mm/s，下压距离2 mm，常温测定。每个处理组取3 个肉块进行测定，每个肉块取6 个肉条平行测定。

1.3.3 表面肉色测定

牛半膜肌表面颜色L*（亮度）、a*（红度）和b*（黄度）值使用色差仪进行测定。测定前色差仪使用白瓷板进行校正。测定条件：D65光源，孔径8 mm，视角10°。打开包装后用滤纸擦干牛肉表面的水分，在其表面不同位置均匀地取点测定。每个处理组取3 个肉块进行测定，每个肉块在其表面不同位置测定5 次。

1.3.4 脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白相对含量测定

脱氧肌红蛋白（deoxy-myoglobin，DMb）、氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，OxgMb）和高铁肌红蛋白（metmyoglobin，MetMb）相对含量的测定参考Krzywicki[11]的方法。每个处理组取3 个肉块进行测定，每个肉块在其表面不同位置测定5 次。DMb、OxgMb、MetMb相对含量分别按公式（1）～（3）计算。

1.3.5 肌浆蛋白、总蛋白溶解度测定

蛋白溶解度的测定参考Joo等[12]的方法并进行适当修改。分别称取1 g已打碎的肉样2 份，一份加入预冷的磷酸盐缓冲液（10 mL 0.025 mol/mL，pH 7.2）用于测定肌浆蛋白溶解度；另外一份加入含1.1 mol/mL碘化钾的磷酸盐缓冲液（20 mL 0.01 mol/mL，pH 7.2）用于测定总蛋白溶解度。用匀浆机以2 500 r/min匀浆1 min，然后2 000×g离心20 min，滤纸过滤后取上清液，用双缩脲法测定溶液的蛋白质量浓度。每个处理组取3 个肉块，每个肉块取3 个样品平行测定。溶解度按式（4）计算。

式中：V表示缓冲液体积/mL；m表示样品质量/g；ρ表示蛋白质量浓度/（mg/mL）。

1.3.6 肌细胞中羰基分布测定

肌细胞中羰基分布测定参照Astruc等[13]的免疫染色法。牛肉样品沿着肌纤维方向切成长约2 cm的细长条，使用液氮冷冻60 s脱水，切片机切成10 μm厚的薄片后置于载玻片上，加入1 mL 0.2 g/100 mL的2,4-二硝基苯肼溶液（溶剂为含0.1 mol/L NaCl的pH 6.0、20 mmol/L磷酸盐缓冲液），放置暗处室温反应16 h，使用20 mmol/L磷酸盐缓冲液（含体积分数0.1%吐温20、0.1 mol/L氯化钠，pH 6.75）洗涤6 次，每次洗涤5 min。使用体积分数10%的兔血清在37 ℃条件下封闭1 h，分别使用一抗（DNPH多克隆抗体）和二抗（CY3羊抗兔免疫球蛋白）孵育14 h和1 h，每次取出后均需使用20 mmol/L磷酸盐缓冲液洗涤6 次，每次洗涤5 min。使用激光共聚焦显微镜观察羰基在牛肉肌细胞中的分布情况。激光共聚焦测定条件：发射波长570 nm，激发波长555 nm，放大200 倍，曝光时间3 s。

1.3.7 硫代巴比妥酸反应物值测定

硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值测定参照王超等[14]的方法。取5 g预先打碎的半膜肌样品置于离心管中，加入20 g/100 mL的三氯乙酸溶液25 mL，2 500 r/min匀浆1 min后于2 000×g离心20 min，过滤定容50 mL得匀浆液。分别取2 mL溶液作为空白对照和实验组，在空白对照组中加入2 mL 100 g/L的三氯乙酸溶液，在实验中加入2 mL 0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸溶液，沸水浴保温20 min后流水冷却5 min，使用分光光度计在510 nm波长处测吸光度。用1 mol/L 1,1,3,3-丙二醛溶液作标准曲线，结果以每千克肉中所含的丙二醛质量表示，单位为mg/kg。每个处理组取3 个肉块进行测定，每个肉块取3 个样品平行测定。

1.3.8 肌钙蛋白-T降解率的测定

肌原纤维蛋白的提取参考Park等[15]的方法。采用双缩脲法测定蛋白质量浓度，并将肌原纤维蛋白质量浓度最终调整为4 mg/mL，分装在100 μL离心管后于-40 ℃冰箱保存备用，用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

参考Fu Qingquan等[16]的免疫印迹法测定肌钙蛋白-T的免疫荧光强度。采用质量分数4%的浓缩胶和质量分数10%的分离胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后立即在4 ℃条件下90 V电压转印120 min，转印后的PVDF膜放入20 mmol/L Tris-base缓冲液（含5 g/100 mL脱脂奶粉、137 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、体积分数0.05%吐温20，下同）中孵育封闭2 h。封闭后的PVDF膜在一抗和二抗溶液中分别孵育15 h和2 h，每次孵育后均需用20 mmol/L Tris-base缓冲液洗涤6 次。取出膜用增强化学发光显色剂在暗处显色5 min后立即用凝胶成像仪进行拍照。肌钙蛋白-T的条带强度用Quantity one软件进行定量分析。肌钙蛋白-T降解率按公式（5）进行计算。

1.4 数据统计分析

采用SAS 8.2软件进行数据处理与分析，结果以平均值±标准差表示，单因素方差分析采用韦尔奇的权重方差分析，差异显著性分析均采用邓肯氏多重比较方法，P＜0.05表示差异显著。采用Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 高氧气调包装对牛半膜肌宰后成熟过程中剪切力的影响

图1 高氧气调包装对宰后牛肉成熟过程中剪切力的影响Fig.1 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on shear force of beef during postmortem aging

嫩度是评价牛肉很重要的品质指标，也是牛肉非常关键的感官特征之一，它直接影响消费者的接受性和二次购买欲望[8]。剪切力是反映鲜肉嫩度最直接的指标，剪切力越小说明鲜肉的嫩度越高[17]。由图1可知，在宰后成熟过程中，高氧气调包装牛肉样品的嫩度显著低于真空包装的牛肉样品（P＜0.05），表明高氧气调包装不利于牛肉嫩度的改善，其原因很可能与高氧条件下引起的牛肉蛋白质氧化加剧有关，蛋白氧化过程中抑制了牛肉本身μ-钙激活酶的活性从而抑制了其对细胞结构蛋白的降解速率[16]。Zakrys-Waliwaner等[18]研究也发现高氧气调包装牛排的嫩度在14 d成熟过程中显著低于真空包装的牛排样品（P＜0.05），与本研究结果类似。

2.2 高氧气调包装对牛半膜肌宰后成熟过程中肉色的影响

颜色是消费者用来评价鲜肉品质的首要指标，它直接影响消费者的购买欲望[19]。如图2所示，宰后成熟过程中高氧气调包装的牛肉样品L*、a*值和b*值显著高于真空包装的牛肉样品（P＜0.05）。高氧气调包装牛肉相对于真空包装样品L*值的增加可能是由蛋白质氧化或交联聚集引起的，尤其是高氧条件下氧气会引起光散射从而增加鲜肉的L*值[20]。而高氧气调包装牛肉的a*值较高可能是气调包装中高浓度的氧使DMb氧化形成OxgMb，OxgMb覆盖在MetMb的表层，从而较长时间保持了OxgMb本身的亮红色[21]。Jayasingh等[22]采用了类似的方法研究牛肉的颜色变化，发现高氧气调包装的牛肉在成熟10 d过程中其a*值显著高于真空包装的牛肉样品，说明高氧气调包装更有利于颜色的改善。Resconi等[23]也研究表明，高氧气调包装（80% O2）有利于维持牛肉较高a*值，即维持较高的色泽稳定性，色泽变化趋势与本研究结果相似。

图2 高氧气调包装对宰后牛肉成熟过程中肉色的影响Fig.2 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on color of beef during postmortem aging

2.3 高氧气调包装对牛半膜肌宰后成熟过程中DMb、OxgMb、MetMb相对含量的影响

由图3可知，宰后成熟过程中，高氧气调包装牛肉样品的DMb和OxgMb相对含量显著低于真空包装的牛肉样品（P＜0.05），而高氧气调包装牛肉样品的MetMb相对含量显著高于真空包装的牛肉样品（P＜0.05）。这说明随着成熟时间的延长，高氧气调包装的牛肉样品在高浓度氧条件下，DMb和OxgMb不断转化为MetMb，导致DMb和OxgMb相对含量不断减少，而MetMb相对含量不断增加。

图3 高氧气调包装对宰后牛肉成熟过程中DMb（A）、OxgMb（B）和MetMb（C）相对含量的影响Fig.3 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on DMb (A),OxgMb (B) and MetMb (C) contents of beef during postmortem aging

2.4 高氧气调包装对牛半膜肌宰后成熟过程中蛋白溶解性的影响

图4 高氧气调包装对宰后牛肉成熟过程中肌浆蛋白（A）和总蛋白（B）溶解度的影响Fig.4 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on sarcoplasmic protein solubility (A) and total protein solubility (B) of beef during postmortem aging

溶解度是反映蛋白质聚集和交联程度的一个重要指标。如图4所示，在宰后成熟4 d，高氧气调包装牛肉样品的总蛋白溶解度和肌浆蛋白溶解度与真空包装牛肉样品相比无显著性差异（P＞0.05）。然而，在宰后成熟7 d和10 d，高氧气调包装牛肉样品的总蛋白溶解度和肌浆蛋白溶解度显著低于真空包装的牛肉样品（P＜0.05），可能是宰后成熟后期现变高氧气调包装牛肉样品蛋白质氧化引起蛋白游离巯基结合形成二硫键，导致蛋白质最终出性聚集并沉淀[24]。Joo等[12]研究表明，肌浆蛋白溶解度较高的肉其亮度相对较低；Choi等[25]研究表明，总蛋白溶解度较低的肉其亮度较高，这与本研究结果具有一致性。

2.5 高氧气调包装对牛半膜肌宰后成熟过程中蛋白氧化程度的影响

图5 高氧气调包装对宰后牛肉成熟过程中肌细胞羰基分布的影响Fig.5 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on protein carbonyl distribution in beef during postmortem aging

通过激光共聚焦显微镜观察蛋白羰基在肌细胞中的分布能更形象地表征蛋白质氧化程度，且还能看出其动态变化过程。图5中白色荧光信号越强，说明蛋白氧化后的羰基含量越高。在宰后排酸24 h（成熟0 d），牛肉部分肌细胞外围出现较弱的荧光信号。在宰后成熟4 d，高氧气调包装的牛肉相对于真空包装组肌细胞外围白色荧光信号开始增强，蛋白质氧化程度增加，在宰后成熟7 d，高氧气调包装的牛肉相对于真空包装组肌细胞外围白色荧光信号增强更加明显，且分布更均匀。在宰后成熟10 d，高氧气调包装的牛肉相对于真空包装组肌细胞外围白色荧光信号快速增强，且白色荧光从肌细胞外向肌细胞内部进行渗透，真空包装的牛肉样品只有肌细胞四周较弱的白色荧光信号。Astruc等[13]的研究结果与本研究类似，其同样发现蛋白质氧化从肌细胞外围的细胞膜氧化开始，随着时间的延长其氧化开始向肌细胞内部渗透，且氧化程度加剧。扶庆权等[26]采用同样的免疫组化技术对高氧气调包装、托盘包装和真空包装3 种包装的牛背最长肌在宰后成熟过程羰基分分布情况时也得到类似的结论，说明高氧气调包装的牛肉样品相对于真空包装更易发生蛋白质氧化。

2.6 高氧气调包装对牛半膜肌宰后成熟过程中脂肪氧化程度的影响

图6 高氧气调包装对宰后牛肉成熟过程中脂肪氧化的影响Fig.6 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on lipid oxidation in beef during postmortem aging

牛肉的脂肪氧化程度可以用脂肪氧化形成的次级产物含量来评估，即用TBARS值表征[27]。由图6可知，在宰后成熟过程中，高氧气调包装组牛肉样品的TBARS值均高于真空包装的牛肉样品，说明高氧气调包装相对于真空包装不利于抑制鲜肉的脂肪氧化，可能原因是高氧气调包装的牛肉样品因高浓度的氧气易于氧化脂肪，而真空包装牛肉样品因氧气浓度低而不易氧化。Smiddy等[28]对熟牛肉进行高氧气调包装和真空包装后贮藏，结果发现高氧气调包装的牛肉样品TBARS值显著高于真空包装牛肉样品。Jongberg等[29]也研究表明，高氧气调包装的鸡胸肉和鸡腿肉在5 ℃贮藏9 d过程中相对真空包装2-硫代巴比妥酸值显著增加。

2.7 高氧气调包装对牛半膜肌宰后成熟过程中肌钙蛋白-T降解率的影响

图7 高氧气调包装对宰后牛肉成熟过程中肌钙蛋白-T降解的影响Fig.7 Effects of high oxygen modified atmosphere packaging on troponin-T proteolysis in beef during postmortem aging

肌钙蛋白-T的主要功能是和原肌球蛋白结合调节肌肉的收缩，对钙离子具有很高的敏感性。钙蛋白-T还是μ-钙激活酶进行酶解的底物，在鲜肉宰后成熟过程中会降解产生30 kDa的产物，肌钙蛋白-T的降解有助于鲜肉嫩度的改善[30-31]。由图7可知，宰后成熟过程中，高氧气调包装的牛肉样品的肌钙蛋白-T降解率显著低于真空包装的牛肉样品（P＜0.05），可能是高氧气调包装下蛋白质氧化程度高，μ-钙激活酶的活性受到抑制，从而使得肌钙蛋白-T的降解率降低[32]。陈琳等[33]的研究结果也发现了同样的变化趋势，其研究发现高氧气体包装的猪肉在宰后成熟6 d肌钙蛋白-T的降解显著低于真空包装组。