新型冠状病毒感染实验动物的风险评估∗

2020-12-31李永超李韵峰关雅伦黄忠强刘书华李雪娇

实验动物科学 2020年5期

李永超李韵峰关雅伦黄忠强刘书华李雪娇李舸张钰

(广东省实验动物监测所,广州 510663)

新型冠状病毒全球大流行严重危害人类的生命,由于病毒在人群的广泛传播导致人类密切接触的实验动物和常见家畜存在感染风险。本文根据新型冠状病毒与ACE2结合位点,通过比对结合位点在不同物种间的变化,预测不同实验动物对新型冠状病毒的易感性,有助于筛选新型冠状病毒感染动物模型,并提醒我们注意疫情期间的实验动物饲养。

1 新型冠状病毒概述

2019年12月暴发的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)可以引起人群聚集性感染,并迅速蔓延[1-2]。SARS-CoV-2可以通过飞沫和接触在人与人之间传播,感染后出现发热、乏力、干咳、呼吸困难,部分严重病例可呈现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克,甚至死亡[1,3]。目前该病毒尚无特效治疗药物和疫苗。

冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒,直径约80～120 nm,病毒有包膜,包膜上存在棘突,整个病毒像日冕,不同冠状病毒的棘突有明显的差异。在冠状病毒感染细胞内有时可以见到管状的包涵体,冠状病毒核酸序列还是RNA病毒中最大的。当前发现冠状病毒的宿主包括人、蝙蝠、骆驼、小鼠、猪、猫、犬、禽类等动物,几乎常见的家畜和模式动物都是冠状病毒的宿主(图1)。已有报道感染人的冠状病毒共 6种,即 HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1 和 MERSCoV,而MERS-CoV-2是第7种能够引起人感染的冠状病毒。

第九次国际病毒学分类委员会报告将冠状病毒科分为三个属,即 α、β和 γ属。其中,β属冠状病毒包括β冠状病毒1、人冠状病毒 HKU1、鼠冠状病毒、家蝠冠状病毒HKU5、果蝠冠状病毒HKU9、严重急性呼吸综合征(SARS)相关病毒等7个种。β冠状病毒1包括人冠状病毒(HCoV-OC43)、猪血凝性脑脊髓炎病毒 (porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHEV)等;鼠冠状病毒包括鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)、大鼠冠状病毒(rat coronavirus);严重急性呼吸综合征(SARS)相关病毒包括SARS病毒和其它SARS样冠状病毒。根据全基因组比较分析,SARS-CoV-2与蝙蝠的RaTG13相似性高达96%,与SARS-CoV相似性约为82%。SARS-CoV-2与RaTG13、SARS-CoV存在于一个进化簇中[4-5],这说明 SARS-CoV-2与 RaTG13、SARS-CoV具有同源性。

图1 冠状病毒进化树注:标尺表示每个核酸位点的替换值,分支长度按每个位点核酸替换的比例绘制,分支上的数字表示在引导重复中该分支的百分比(引自GISAID)Fig.1 Phylogenetic analysis of coronavirus familyNote:The scale bars represent 1000 substitutions per nucleotide position,Branch lengths are drawn to a scale of nucleotide substitutions per site and Numbers above individual branches indicate percentage bootstrap replicates(from GISAID)

2 新型冠状病毒感染机制分析

冠状病毒首先通过棘突蛋白(spike)吸附在宿主细胞表面,然后进入宿主细胞、启动复制增殖。冠状病毒spike蛋白包括S1与S2两个亚基,S1亚基分为S1-NTD(N terminal domain)和S1-CTD(C-terminal domain)两个结构域,它们都可以作为受体结合结构域(receptor-binding domain,RBD)。冠状病毒RBD参与结合宿主受体,这些宿主受体包括血管紧张素Ⅰ转化酶2(angiotensin I converting enzyme 2,ACE2)、二肽基肽酶 4(dipeptidyl peptidase 4,DPP4)、氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)和癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen related cell adhesion Molecule 1,CEACAM 1)等[6]。其中β属SARS-CoV的S1-CTD与ACE2蛋白结合[7],MERS-CoV S1-CTD与 DPP4蛋白结合[8],TGEV和PRCV S1-CTD与APN结合[9-10],MHV S1-CTD与小鼠 CEACAM 1受体结合[11]。同属冠状病毒S1-CTD高度相似,但识别的受体不同,然而不同的冠状病毒S1-CTD也可以识别相同的受体[6]。

SARS-CoV和SARS-CoV-2与宿主细胞结合的受体均为ACE2[7,12],我们对人、模式动物和常见家畜等ACE2蛋白进行进化分析(图2)发现,人与黑猩猩、非洲绿猴、恒河猴的 ACE2蛋白进化关系较近;人与小鼠的ACE2同源性约为82%,与仓鼠的同源性约为84%。通过蛋白结构预测和三维结构分析均发现,SARS-CoV-2在与ACE2受体结合感染人的过程中,其S蛋白的胞外域与ACE2的亲和力比SARS-CoV高10～20倍[13],而且 SARS-CoV-2在人群的感染有隐蔽性,因此 SARS-CoV-2在人类及动物中的传播能力可能远远高于SARS-CoV。

图2 ACE2蛋白进化树注:根据各物种ACE2蛋白的氨基酸序列,利用MEGA X软件(Neighbor-joining法,bootstrap为1000)构建进化树,标尺表示每个氨基酸位点的替换值0.02Fig.2 The phylogenetic relationships of ACE2 proteinNote:Phylogenetic analysis was performed using MEGA X software and Neighbor-joining methods with bootstrap value 1000.The scale bars represent 0.02 substitutions per amino acid

3 实验动物对新型冠状病毒的易感性评价

已有报道,SARS-CoV可以感染非洲绿猴、恒河猴、食蟹猴、猪、鸡、猫、雪貂、小鼠和仓鼠等动物[14-20]。Lu等[21]通过比较 ACE2上与 SARS-CoV RBD结合的氨基酸残基位点在不同物种间的变化(表1),分析SARS-CoV的跨物种传播能力,结果显示SARS-CoV可以感染的宿主包括人类、非洲绿猴、恒河猴、狨猴、仓鼠、猫、果子狸、浣熊、雪貂、小鼠和蝙蝠[21-22]。其中,非洲绿猴、恒河猴与人类的ACE2位点氨基酸完全一样,易被SARS-CoV感染。而其他动物与人类ACE2的结合位点存在2～9个突变,与SARS-CoV RBD结合强弱不同,但这些动物仍然能够被感染,突变位点越少的动物被病毒感染的风险越大。大鼠和小鼠在结合位点的突变高达9个,与SARS-CoV RBD结合能力较弱,病毒感染后症状相对较轻。只有在高表达人ACE2的转基因小鼠中,SARS-CoV才能有效地感染小鼠并导致死亡,同时产生典型的肺、脑等组织病变特征[23-24]。

表1 ACE2与SARS-CoV的结合位点及其在不同物种间的变化Table 1 The variant of binding sites between ACE2 and SARS-CoV in different species

虽然SARS-CoV-2与SARS-CoV的结合受体均为ACE2,但二者基因组相似性只有约82%。ACE2与SARS-CoV-2 RBD的结合位点有13个,且这些位点大多与ACE2和SARS-CoV的结合位点不同[12]。通过对人、模式动物和常见家畜及其他动物 ACE2上与SARS-CoV-2 RBD结合的氨基酸残基位点进行分析(表2)发现,ACE2上与SARS-CoV-2 RBD的结合位点在不同物种间更加保守。其中,恒河猴、仓鼠与人的位点完全一样;牛、山羊、绵羊、狨猴、兔子分别有2个位点不一样;猪、猫、骆驼、穿山甲分别有3个位点不一样;而蝙蝠中,中华菊头蝠有4个位点不同和皮氏菊头蝠有5个位点不同。雪貂、小鼠和大鼠分别有5、5、6个位点不同。因此,位点比较结果表明SARS-CoV-2最易感的动物可能是猴和仓鼠。目前的研究也证实,猴仍然是构建 SARS-CoV-2感染模型最L想的模式动物。基于我们对ACE2的结合位点分析,仓鼠可能也对新型冠状病毒易感,但该结果还需要进一步的病毒学实验进行验证。与SARS-CoV不易感染小鼠相同,野生型小鼠对SARSCoV-2同样表现为不易感。Bao等[25]也证实,只有携带人hACE2的转基因小鼠才能够被SARS-CoV-2感染,且肺部表现毛玻璃症状。动物模型是新冠病毒研究的重要工具,开展动物受体结合位点比对分析,筛选对 SARS-CoV-2易感的动物,对提升动物模型研究,加快药物和疫苗的研究具有重要意义。