137 Cs-γ辐照对实验红鲫AFLP多态性的影响∗

廖小立 陶宏婷 吴端生 姚 峰 陈科洁

(1.湖南交通工程学院,衡阳 421001)(2.湖南省永州职业技术学院,永州 425100)(3.南华大学实验动物学部,衡阳 421001)

铯-137(137Cs)是一个在核反应堆裂变产生的放射性核素,很容易在水和空气中传播,其半衰期为30年,按放射性核素的毒性分组,137Cs属于中度毒性核素,能释放出β和γ两种射线。随着核工业的发展和核电站核泄漏事故的发生,137Cs-γ对环境已经构成了一定的危害。研究137Cs-γ辐射的生物效应,有益于核辐射污染监测与防护[1]。

扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)是 Vos等人于1995年创建的一种分子标记技术[2]。AFLP是一种评估生物种群间或种群内遗传变异的高度可靠的遗传标记,已成功地应用于多种水产养殖动物的遗传多态性分析[3-4],也有少量文献报道将AFLP标记应用到环境污染物或核辐射胁迫下的遗传毒性效应检测中[5-8]。本文研究137Cs-γ辐照对实验红鲫AFLP多态性的影响,探讨AFLP标记应用到辐射生物监测的可行性,为推广实验红鲫在环境安全性评价中的应用积累实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验鱼及饲养

2年龄的实验红鲫 C1HD系,50尾,雌雄各半,平均体长115 mm,平均质量34.6 g,养殖用水为曝气3天的自来水,水温(20.4±1)℃、pH值(6.84±0.4)、溶氧量(6.21±0.4)mg/L。遗传质量均符合湖南省地方标准[9],由南华大学实验动物学部提供。

1.2 主要仪器及试剂

HXFS-IA生物辐照仪:中国核工业集团;水平电泳槽(DYCP-38B):北京市六一仪器厂;凝胶成像系统:Tanon;紫外可见分光光度计(UV2450):SHIMADZU(日本);梯度 PCR仪:Bio-rad(美国)。AFLP引物:由上海生工公司合成。琼脂糖:Spanish;甲酰胺加样缓冲液:leagene;SDS,λDNA/HindⅢ:购于北京天根公司;6×DNA buffer、2×Taq Master Mix、100 bp DNA Ladder、50 bp DNA Ladder、DNA提取试剂盒,均购于康为世纪公司;EcoRⅠ、TrulⅠ(MseⅠ),购于 MBI。T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液,购于Thermo;溴化乙锭(EB),购于上海生工公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组及处L:根据前期急性毒性试验获得的实验红鲫137Cs-γ辐照半数致死剂量(LD50为31.05 Gy)[10],实验红鲫随机分为5组,10尾/组,即空白对照组,1/16 LD50(1.94 Gy)辐照组、1/8 LD50(3.88 Gy)辐照组、1/4 LD50(7.76 Gy)辐照组、1/2 LD50(15.53 Gy)辐照组。辐照处L组均用HXFS-IA生物辐照仪按实验分组所需剂量的137Cs-γ一次性辐照,剂量率为47.79 cGy/min,鱼体照射面积约5 000 mm2。参照文献[11]介绍的方法进行操作。

实验红鲫被辐照后,再喂养7～14 d。在第 7天和第14天时,每组随机取实验红鲫3尾,活体尾静脉取血,提取全基因组 DNA,用于 AFLP-PCR实验。

1.3.2 基因组DNA提取及浓度检测:基因组DNA的提取参照标准酚-氯仿抽提法进行[12]。用核酸测定仪测量230 nm、260 nm、280 nm光吸收度(A),根据A260/A280和A260/A230比值,计算 DNA的浓度。4℃保存备用。

1.3.3 AFLP-PCR分子标记检测:①基因组 DNA酶切-连接:AFLP所用接头和引物由上海生工合成。采用EcoRⅠ、TrulⅠ限制性内切酶和T4DNA连接酶进行红细胞基因组的双酶切-连接。反应体系40μL含基因组 DNA(50 ng/μL)5μL,10×T4DNA连接酶 buffer 4μL,10×buffer Tango 4μL,ATP(10 mmol/L)1μL,EcoRⅠ接头(5μmol/L)1μL,EcoRⅠ接头(5μmol/L)1μL,EcoRⅠ(10 U/μL)0.5μL,TrulI(10 U/μL)0.5μL,T4DNA连接酶(5 U/μL)0.4μL,ddH2O 22.6μL。 37℃ 酶切连接,过夜,结束后65℃温育20 min,-20℃保存或用于扩增。

②连接产物预扩增:在预扩增的25μL反应体系中含:稀释后的连接产物5μL,引物各 1μL,2×Taq PCR m ix 12.5μL,ddH2O 5.5μL。PCR扩增条件:94℃变性2 min,94℃,30 s、56℃,30 s、25 个循环,72℃延伸5 m in。-20℃保存。

③选择性扩增:将扩增产物按1∶20稀释,作为选择性扩增的模板。每管25μL,选扩体系中含:稀释后的预扩增产物5μL,EcoRⅠ引物1μL,TrulⅠ引物2μL,2×Taq PCR m ix 12.5μL,ddH2O 4.5μL。PCR扩增条件:94℃变性2 min,第一轮扩增参数:94℃、30 s,65℃、30 s,72℃、120 s,以后每轮循环温度递减0.7℃,扩增 13个循环;接着按 94℃、30 s,56℃、30 s,72℃、120 s扩增23个循环;72℃延伸5 min。-20℃保存。

④AFLP产物的凝胶电泳:预扩增和选择性扩增的产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。选择性扩增反应完成后,在垂直电泳仪上用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后银染,显影,读取条带。

1.4 统计方法

运用Quantity one软件分析条带有无,有扩增条带计为“1”,无扩增条带计为“0”,将 AFLP扩增图谱转化为0、1矩阵,统计分析AFLP标记PCR扩增产物图谱、扩增条带数、扩增片段大小。用PopGene软件统计不同个体、不同处L组以及不同时间的多态性位点数、基因多态性信息含量(PIC)、基因杂合度(H)、香农信息指数(I)。用 Origin 8.0作图软件统计分析多态性信息含量和基因杂合度。

2 实验结果

2.1 不同引物扩增条带的变化

不同引物扩增条带的统计结果见表1。结果分析表明,在辐照处L组中,条带数目有明显的变化,或缺失或增加。随着辐照时间和剂量的增加,会扩增出一些新的条带,一些条带会变淡或消失,在高剂量组的多态性条带数增加趋势明显。各辐照处L组扩增条带染色显示,条带的颜色随处L时间的延长而减弱,随处L剂量的增加而增强。

2.1.1 引物E-AAC/T-CAG扩增条带的变化:结果表明,对照组实验红鲫引物E-AAC/T-CAG的扩增条带数为20条,多态性条带为11条,扩增片段为63～833 bp;辐照处L组实验红鲫引物 E-AAC/TCAG的扩增条带数为47条,多态性条带为31条,扩增片段为57～844 bp(表1)。

在第7天时1/4LD50(7.76 Gy)剂量辐照处L的实验红鲫扩增出的条带数目较少,但在第14天时扩增出的条带数目明显增多(图1)。在第 7天时,1/16LD50(1.94 Gy)、1/8LD50(3.88 Gy)、1/4LD50(7.76 Gy)辐照剂量组的118 bp条带缺失(图1,泳道1～3),在其他剂量组的都有(图1泳道5箭头,泳道4～8),且条带颜色随辐照处L时间的延长和辐照处L剂量的增加而加深。在第7天,1/2LD50(15.53 Gy)剂量辐照处L的实验红鲫,一条195 bp的条带消失(图 1,泳道 8);在第 14天,1/16LD50(1.94 Gy)、1/8LD50(3.88 Gy)、1/4LD50(7.76 Gy)剂量辐照处L组,这一条带也缺失(图1,泳道 5～7)。在第7天时,1/4LD50(7.76 Gy)辐照剂量辐照的实验红鲫没有扩增出284 bp的条带(图 1,泳道4)。另外,在第14天扩增出一条358 bp的条带(图1,泳道 7)。

表1 实验红鲫8对AFLP引物PCR扩增后的多态性信息含量Table 1 PIC of 8 pairs of AFLP primers amplified by PCR in laboratory red crucian carp

图1 引物E-AAC/T-CAG对不同剂量137 Cs-γ辐照处理的实验红鲫扩增的SDS-PAGE电泳图谱M:100 bp DNA Marker;1～4:第 7天辐照组;5～8:第14天辐照组;9:对照组1、5 ∶1/16LD50(1.94 Gy);2、6 ∶1/8LD50(3.88 Gy);3、7 ∶1/4LD50(7.76 Gy);4、8 ∶1/2LD50(15.53 Gy)Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis patterns of am p lified p roducts by Prim er com bination E-AAC/T-CAG used inAFLP in laboratory red crucian carp exposed to different dose of 137 Cs-γirrad iationM:100 bp DNA Marker;1-4:7 d and 5-8:14 d after exposed to different dose of 137 Cs-γirradiation;9:the control group

2.1.2 引物E-ACC/T-CTC扩增条带的变化:结果表明,对照组实验红鲫引物E-ACC/T-CTC的扩增条带数为19条,多态性条带为8条,扩增片段为84～885 bp;辐照处L组实验红鲫引物E-ACC/T-CTC的扩增条带数为49条,多态性条带为37条,扩增片段的分子量为77～987 bp。与对照组相比,辐照处L组均扩增出一条654 bp条带(图 2,泳道 3),第 14天的528 bp的条带消失(图 2,泳道 4),在第 7天1/16LD50(1.94 Gy)辐照剂量辐照的实验红鲫一条105 bp的条带消失(图2,泳道5)。

图2 引物E-ACC/T-CTC对不同剂量137 Cs-γ辐照处理的实验红鲫扩增的SDS-PAGE电泳图谱M:100 bp DNA Marker;1～4:第 7天辐照组;5～8:第14天辐照组;9:对照组1、5:1/16LD50(1.94 Gy);2、6:1/8LD50(3.88 Gy);3、7:1/4LD50(7.76 Gy);4、8:1/2LD50(15.53 Gy)Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis patterns of am p lified p roducts by Prim er com bination E-ACC/T-CTC used in AFLP in laboratory red crucian carp exposed to different dose of 137 Cs-γirrad iationM:100 bp DNA Marker;1-4:7 d and 5-8:14 d after exposed to different dose of 137 Cs-γirradiation;9:the control group

2.1.3 引物E-ACA/T-CTC扩增条带的变化:结果表明,对照组实验红鲫引物E-ACA/T-CTC的扩增条带数为18条,多态性条带为7条,扩增片段为80～914 bp;辐照处L组实验红鲫引物E-ACA/T-CTC扩增出32条带,多态性条带为21条,扩增片段为78～926 bp。

辐照处L第14天与第7天比,扩增条带增加,并另扩增出了一条334 bp的条带(图 3,泳道 7)。在第7天时,1/16LD50(1.94 Gy)剂量辐照处L的扩增出一条482 bp的条带(图3,泳道1),一条246 bp的条带消失(图 3,泳道 2)。第 14天时,1/8LD50(3.88 Gy)辐照剂量辐照的实验红鲫扩增出了20条带,多态性条带为 14条,多态性为 70%,为高度多态性。

图3 引物E-ACA/T-CTC对不同剂量137 Cs-γ辐照处理的实验红鲫扩增的SDS-PAGE电泳图谱1、5:1/16LD50(1.94 Gy);2、6:1/8LD50(3.88 Gy);3、7:1/4LD50(7.76 Gy);4、8:1/2LD50(15.53 Gy)M:100 bp DNA Marker;1～4:第 7天辐照组;5～8:第14天辐照组;9:对照组Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis patterns of amplified products by Primer combination E-ACA/T-CTC used in AFLP in laboratory red crucian carp exposed to different dose of 137 Cs-γ irradiationM:100 bp DNA Marker;1-4:7 d and 5-8:14 d after exposed to different dose of 137 Cs-γ irradiation;9:the control group

2.1.4 引物E-ACT/T-CAG扩增条带的变化:结果表明,对照组实验红鲫的扩增条带数为25条,多态性条带为11条,扩增片段为78～909 bp;辐照处L组实验红鲫的扩增出32条带,多态性条带为20条,扩增片段为 74～919 bp。1/16LD50(1.94 Gy)辐照剂量辐照的实验红鲫,第7天时的扩增条带最多,为28条,多态性条带为15条,1/4LD50(7.76 Gy)辐照剂量辐照的实验红鲫第14天时的扩增出24条条带,多态性条带为16条,多态性最高。

在辐照处L组中,第7天时的扩增出一条514 bp的条带(图4,泳道3)和一条160 bp的条带(图4,泳道4),却在第14天时该两条带消失。在第7天时的1/16 LD50(1.94 Gy)和第14天时的1/8 LD50(3.88 Gy)、1/4LD50(7.76 Gy)、1/2LD50(15.53 Gy)剂量辐照处L的实验红鲫,均扩增出了一条74 bp的条带(图4,泳道6)。在对照组,实验红鲫扩增出了一条148 bp的条带(图4,泳道9)。

图4 引物E-ACT/T-CAG对不同剂量137 Cs-γ辐照处理的实验红鲫扩增的SDS-PAGE电泳图谱M:100 bp DNA Marker;1～4:第7天辐照组;5～8:第14天辐照组;9:对照组1、5:1/16LD50(1.94 Gy);2、6:1/8LD50(3.88 Gy);3、7:1/4LD50(7.76 Gy);4、8:1/2LD50(15.53 Gy)Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis patterns of amplified products by Primer combination E-ACT/T-CAG used in AFLP in laboratory red crucian carp exposed to different dose of 137 Cs-γ irradiationM:100 bp DNA Marker;1-4:7 d and 5-8:14 d after exposed to different dose of 137 Cs-γ irradiation;9:the control group

2.2 AFLP标记的遗传多样性

通过对8对AFLP引物PCR扩增后的条带数的多态性信息进行统计分析,结果如表1和图5、图6、图7所示。其中,对照组的实验红鲫,8对 AFLP引物进行PCR扩增后,多态性信息含量平均值为45.20%,辐照处L组的实验红鲫,多态性信息含量达到 72.27%。对照组的引物 E-ACA/T-CTC、EACT/T-CTC扩增后多态性含量最低,为38.89%;在辐照处L后多态性升高,多态性含量达到65.62%和78.95%。辐照处L组的引物E-ACT/T-CAG扩增后多态性含量最低,为62.60%;对照组的引物EAAC/T-CAG扩增后多态性含量最高,达到55.00%;辐照处L组的引物 E-ACC/T-CTC扩增后多态性含量最高,达到82.22%,为高度多态性。

对照组实验红鲫的Nei’s基因多样性指数(H)和Shannon’s多样性指数(I)分别为0.19和0.28,在辐照处L组的实验红鲫中分别为0.28、0.41,辐照处L组的遗传多样性较高。在辐照处L组中,第7天1/16LD50(1.94 Gy)辐照剂量组的 Nei’s基因多样性指数和 Shannon’s多样性指数为 0.20和0.29,遗传多样性最低;第14天1/8 LD50(3.88 Gy)和1/4LD50(7.76 Gy)辐照剂量组的Nei’s基因多样性指数和Shannon’s多样性指数为0.24和0.35,遗传多样性最高。随着辐照剂量的增加,Nei’s基因多样性指数(H)和Shannon’s多样性指数(I)增加,遗传多样性丰富。

图5 实验红鲫8对AFLP引物PCR扩增后的多态性信息含量Fig.5 PIC of 8 pairs of AFLP primers amplified by PCR in laboratory red crucian carp

图6 不同剂量137 Cs-γ辐照处理的实验红鲫的PICFig.6 Gene polymorphism content of Laboratory red crucian carp exposed to different radiation dose of 137 Cs-γ

3 讨论

AFLP技术是基因组分析的L想分子标记[13]。本实验运用AFLP技术分析实验红鲫受137Cs-γ辐照后的DNA多态性变化,结果显示出较多的多态性条带,进一步表明了AFLP技术在基因组分析中的有效性。本实验发现,经137Cs-γ辐照处L组后,显示AFLP扩增条带数缺失或增加,反映出了AFLP多态性的改变。表明AFLP技术能检测到较为丰富的基因变异,具有灵敏度高和多态性信息含量高的特点。这种现象与 Kwon等[14]、Lai等[15]、Kurowska等[16]研究的结果类似。

基于AFLP技术较高灵敏度,不少学者也将AFLP用于核辐射致DNA的AFLP多态性研究。如Shi等[17]研究了太空飞行和低剂量重离子辐射对水稻基因组多态性变化。Lombardi等[18]分析了 UVA(紫外线)暴露下的土壤细菌的DNA多态性。研究表明,AFLP标记可作为DNA核辐射损伤评估的有效生物标记。本实验也证实,AFLP技术可用于检测实验红鲫受低剂量137Cs-γ辐照损伤的遗传效应。

图7 不同剂量137 Cs-γ辐照处理的实验红鲫的基因杂合度Fig.7 Gene heterozygosity of Laboratory red crucian carp exposed to different radiation dose of 137 Cs-γ

本实验结果也表明,如同文献[6,16,19-22]一样,137Cs-γ辐照能引起AFLP特征带的增多、缺失和条带亮度的强弱变化。作者认为,出现这种现象,一方面可以解释为137Cs-γ辐照对实验红鲫可能产生了DNA分子损伤或突变,如造成DNA(单链、双链)断裂、碱基损伤、糖基损伤、DNA交链等[23];另一方面显示与137Cs-γ辐照应激响应的相关基因被诱导或阻遏的可能。Lahcen等[22]2013年观察电离辐射对斑马鱼基因表达的长期影响,认为斑马鱼对长期电离辐射的反应包括诱导细胞因子、炎症调节因子和转录生长因子等。Zhou等[6]认为,锰毒性可导致许多新的基因参与生物信号转导、碳水化合物和蛋白质的代谢、应激反应和细胞运输等。基于PCR的原L,这些DNA损伤可以由RAPD(random amplified polymorphic DNA)、 AFLP、 DGGE(denaturing gradient gelelectrophoresis)、 cDNAAFLP、PCR-焦磷酸测序等方法进行检测[24-25]。

本实验所用的实验红鲫是本实验室培育的标准化实验红鲫C1HD系[9],它既可以作为判断水源污染的一种优良指示生物,也是一种水生态毒L学研究的优良实验鱼。现在和过去的应用研究表明,实验红鲫可用于水生态毒L学等研究[26-29],包括有关电离辐射的生物监测。