制作简易实验动物雾化箱建立小鼠哮喘模型研究∗

田 丹 许虎峰

(首都医科大学附属北京友谊医院科研实验中心 北京市临床医学研究所 移植耐受与器官保护北京市重点实验室 王松灵院士口腔与全身健康免疫研究实验室 北京 100050)

哮喘在全世界的发病率正在逐步上升,目前已经成为全球人类健康的巨大威胁[1]。雾化吸入给药是临床治疗呼吸道相关疾病的重要治疗手段,也是实验室进行呼吸道相关疾病研究的重要实验方法[2]。目前越来越多的医疗厂商开发出小巧高效的药物雾化吸入仪器用于各种呼吸道患者的居家给药。相对家用型雾化器,用于动物研究的特制雾化箱可选型号少、价格偏高且便携性偏低。因此,应用简单易操作的方法将家用型医疗雾化吸入装置改造为实验动物雾化箱将为呼吸道疾病的顺利研究提供便利。

本研究将利用家用雾化器和动物实验室常见的独立通气鼠笼改造为实验动物用雾化箱,并进行小鼠过敏性哮喘造模。结合家用雾化器易得与价格低廉的特点和实验室已有条件以低成本制成动物呼吸道相关实验的稳定模型。

1 实验动物雾化箱制作与使用

1.1 制作材料

空气压缩式雾化器(鱼跃医疗,型号403M)、橡皮筋、独立通气鼠笼(弘腾生物科技,型号9085D-64)

1.2 制作方法

清空鼠笼,取下鼠粮槽和鼠笼盖,由外向内推进鼠笼盖通气阀并摘下固定橡胶圈,拆卸下鼠笼通气口的弹簧和单向通气阀(仅拆卸其中一个通气阀即可)。摘下家用雾化器雾化杯上的面罩,将橡皮筋缠绕并套在雾化杯出口,保持适度松紧。将雾化杯旋转插入鼠笼通气阀的接口中,保持稳定。将雾化杯通过软管连接上雾化器(图1、图2)。

1.3 使用方法

雾化杯中加入不超过8 m L需要雾化的液体,将雾化杯盖紧杯盖。开启电源雾化后即可见白雾从通气口喷入雾化箱,持续雾化半分钟后雾化气体即可充满整个小鼠鼠笼。每个雾化箱同时可给1～20只小鼠进行雾化处L,8 m L雾化液体可持续雾化至少30 min。

2 利用自制雾化箱进行小鼠过敏性哮喘造模

2.1 实验材料

图1 制作简易实验动物雾化箱所需要的的材料注:A.制作简易实验动物雾化箱的主要材料;B.制作雾化箱需要的家用雾化器配套的雾化杯(出雾口直径2.3 cm);C.制作雾化箱需要的小鼠笼盖(通气口内径2.7 cm);① 家用雾化器主机;② 家用雾化器配套的雾化杯;③ 橡皮筋;④ 独立通气鼠笼;⑤ 通气口上拆卸下来的通气阀;⑥ 通气阀上的固定橡胶圈;⑦安装上通气阀的鼠笼通气口;⑧ 卸下通气阀的鼠笼通气口;⑨独立通气鼠笼盖上的空气过滤Fig.1 The materials used to manufacture the experimental animal atomization boxNote:A The materials used to manufacture the experimental animal atomization box;B atomization cup(outlet diameter:2.3 cm);C atomization box cover (outlet diameter:2.7 cm);①household medical atomizer;②atomization cup of household medical atomizer;③rubber band;④individually ventilated cage;⑤vent valve of mouse cage;⑥rubber ring of vent valve;⑦cage outlet blocked with vent valve;⑧cage outlet unblocked with vent valve;⑨air filtration window on cage cover

图2 组装完毕的雾化箱注:图中蓝色箭头表示开启雾化后的雾化气流方向Fig.2 Assembled atomization boxNote:The blue arrow shows the direction of automization plow

6～8周龄雄性 C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2016-001。在首都医科大学附属北京友谊医院动物实验中心SPF级动物房饲养。所有动物实验均经首都医科大学附属北京友谊医院动物伦L委员会批准(批号:12-2001)。其他相关试剂:鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA,Sigma公司,货号A2512,纯度≥98%,用于腹腔注射;货号 A5378,纯度≥90%,用于雾化吸入),ImjectTMAlum铝佐剂(Thermo公司,货号77161),磷酸缓冲液(Corning公司,货号21-031-CVR)。

2.2 哮喘造模方法

取6～8周龄雄性C57BL/6小鼠,在第0天和第14天进行腹腔注射20μg OVA蛋白免疫原(体积100μL,含 50μL ImjectTMAlum铝佐剂和50μL磷酸缓冲液),对照组小鼠仅注射100μL磷酸缓冲液。从第28天开始,连续3 d应用自制雾化箱对两组小鼠进行雾化1%OVA吸入,每次吸入30 m in。 在第32天,处死小鼠,取小鼠肺组织,进行石蜡包埋、切片和苏木精-伊红染色[3]。

2.3 造模效果检测

将小鼠肺组织进行4%甲醛固定、石蜡包埋固定和切片,之后对切片进行苏木精-伊红染色。光学显微镜下观察小鼠肺组织的炎症细胞浸润程度。如图3所示,与仅进行1%OVA吸入的小鼠相比,进行2次OVA免疫和3次1%OVA吸入后,小鼠肺脏支气管壁明显增厚,肺组织产生大量炎症细胞浸润,表明成功建立了OVA诱导的小鼠过敏性哮喘模型。

图3 利用自制雾化箱建立小鼠过敏性哮喘模型注:A.小鼠过敏性哮喘造模过程流程图;B.仅接收雾化吸入 OVA的小鼠肺脏;C.进行腹腔注射OVA蛋白和雾化Fig.3 Build the mouse allergic asthma model with self-designed atomization boxNote:A.Schematic representation of the mouse allergic asthma procedure;B.The mouse was only inhaled with OVA;C.The allergic asthma mouse was vaccinated with OVA intraperitoneally and inhaled with OV

3 讨论

本自制实验动物雾化箱主要成本来自家用雾化器,市场售价不到300元,成本低廉,购买方便。该雾化器产生的雾化颗粒大小为3.9μm,5μm以下颗粒占比大于65%,能将雾化药物充分运送至肺部支气管[4]。雾化气流量可达 10 L/min,最大雾化率≥0.2 m L/m in完全满足了动物实验的雾化需求。

除了主要部件雾化器外,本模型中还应用到了动物实验室中广泛使用的独立通气鼠笼。该型号鼠笼的通气口内径略大于雾化杯外径,因此便于研究人员通过简单的橡皮筋连接雾化杯和鼠笼并成功改造成为雾化箱。该型号鼠笼由于结构简单易得和拆卸方便,大量应用于动物实验室,并且在雾化吸入实验完成后可以重新组装为动物饲养笼具。本制作方法也利用了该鼠笼拆卸简便的特点,将两个通气口中的一个拆卸下来,改造为雾化杯的通气出口。如果需要加速雾化箱内的气体流通,可以将另一通气口也拆下,外接导管至水中。这种改造方法将使雾化箱中的空气流动更加充分。本制作方法充分利用了独立通气鼠笼良好的过滤通气特点,导入鼠笼内的药物经鼠笼上方的过滤窗过滤后排到笼外,不会污染雾化箱外空气。保证实验环境的清洁和实验人员的安全。

本雾化箱设计简单小巧,便于维护、搬运,在动物实验室中转运操作时只需要带入雾化器和橡皮筋等材料,方便消毒操作。同时本雾化箱具有继续改装潜力,除了打开另一通气口作为通气出口,雾化器还可依据相同的通气口大小匹配更大的笼具,为大鼠等更大体积实验动物的雾化吸入实验提供可能。

本研究利用家用雾化器和动物实验室独立通气鼠笼制作了简易实验动物雾化箱。我们利用该实验动物雾化箱成功建立OVA蛋白诱导的小鼠过敏性哮喘模型并观察到明显的肺组织炎症表现。该方法为简便和低成本地进行实验动物雾化实验提供具有操作性的指导。