实验兔和猫在降压物质检查中的比较研究∗

黎家敏 马佳丽 杨 春 邓 林 马文静 荣祖元

(四川省食品药品检验检测院,成都 611731)

组胺、缓激肽一类的物质因具有血管扩张作用,在注入机体后易引起血压快速下降[1]。由动植物或微生物发酵物提取的药品中可能混入使血管扩张而降低血压的活性物质(包括组胺、缓激肽等组胺类物质),中药中的复杂成分也含有大量降低血压的已知或未知物质,静脉微量注射该类物质即有急性降低血压作用,发生严重的心血管系统不良反应。因此,降压物质检查在化学药品(尤其是生化药)和中药注射剂的安全性评价中发挥着重要作用,对控制药品质量、保障用药安全也具有重要意义。

降压物质检查法早已收录于中国药典和欧洲药典等国内外著名药典的附录中,是药品检验和安全性评价研究的法定标准。国内外药典也均采用猫作为降压物质检查的实验对象。然而,由于目前国内缺乏标准化实验动物猫生产供应,长期以来降压物质检查试验中所用的猫绝大多数是从商贩或收购型饲养场购买,猫的来源、遗传背景、年龄、健康状况、微生物和寄生虫等携带状况等均不清楚,实验结果存在未知因素的干扰,严重影响试验结果和检验报告的科学性与公信力,也可能给实验人员的健康安全埋下隐患。因此,在标准化实验猫的来源尚未得到解决之前,寻找实验猫的替代动物或降压物质检查的替代方法已成为可选途径。

本研究拟将与猫体型大小、遗传背景比较清楚、易于实验操作和价格比较低廉的常用实验兔作为研究对象,通过比较实验兔和猫在降压物质检查中的灵敏度和重现性,以探索实验兔在降压检查中应用是否具有可行性,从而为尽快解决目前降压物质检查中实验用猫的合法性问题或推动实验用猫的实验动物标准化、产业化以及相关降压作用机L研究提供一定的L论基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级新西兰兔、日本大耳白兔和青紫蓝兔各6只,雌雄均各半,购自邳州市东方养殖有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(苏)2017-0002。猫6只,雌雄各半,购自成都达硕实验动物有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(川)2019-031。实验兔和猫均饲养于四川省食品药品检验检测院安全评价中心普通级动物房,实验动物使用许可证号:SYXK(川)2015-127,温度:18～22℃,相对湿度:40%～70%,自由饮食,光照周期为12 h/12 h。

1.2 药品与试剂

磷酸组胺标准品,批号:150510-201313,规格:约20 mg,来源:中国食品药品检定研究院提供;戊巴比妥钠,批号:130315,规格:25 g/瓶,德国默克公司生产;肝素钠注射液,批号:151710086 A,规格:2 m L/12 500单位,常州千红生化制药股份有限公司生产;0.9%氯化钠注射液,批号:G118021804,规格:100 m L/0.9 g,四川科伦药业股份有限公司生产;生脉注射液,批号:19030102001,规格:20 mL/支,华润三九(雅安)药业有限公司生产。

1.3 仪器

RM 6280C多道生L信号采集处L系统,成都仪器厂;CPA225D电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;MW-6电子台秤,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 3种不同品种实验兔对组胺和生脉注射液降压试验的比较:参照《中国药典》降压物质检查法[2],取健康合格的普通级日本大耳白兔、新西兰兔和青紫蓝兔各6只,先给予50 mg/kg戊巴比妥钠经耳缘静脉缓慢注射进行麻醉后,固定于恒温手术台上,进行手术操作分离一侧颈动脉,插入连接生L信号采集处L系统的动脉插管,管内充满约750 U/m L肝素钠溶液作为抗凝剂,记录动物血压;普通级日本大耳白兔、新西兰兔采用耳缘静脉,青紫蓝兔采用另一侧颈静脉,依次给予0.05μg/kg、0.1μg/kg和 0.15μg/kg组胺对照品溶液作为一个给药组,每只家兔分别重复上述给药组3次,然后再继续给予0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg、5μg/kg组胺对照品以及 0.5 m L/kg和1 m L/kg生脉注射液,比较各品种实验兔对组胺物质降压反应的敏感性、重现性和血压稳定性等,同时考察其组胺灵敏度试验结果是否符合《中国药典》的要求和对生脉注射液的降压反应情况。

1.4.2 猫对组胺和生脉注射液降压试验:取健康合格的猫6只,按45 mg/kg给药剂量,经腹腔注射戊巴比妥钠溶液进行麻醉后,固定于恒温手术台上,进行手术操作分离一侧颈动脉,插入连接生L信号采集处L系统的动脉插管,管内充满约750 U/m L肝素钠溶液作为抗凝剂,记录动物血压;经另一侧股静脉依次注射药液。参照《中国药典》降压物质检查法[2],依 次 给 予 0.05μg/kg、 0.1μg/kg 和0.15μg/kg组胺对照品溶液作为一个给药组,每只猫分别重复上述给药组3次,然后再继续给予0.5μg/kg、1μg/kg组胺对照品以及0.5 m L/kg和1 m L/kg生脉注射液,考察其组胺灵敏度试验是否符合要求和对生脉注射液的降压反应情况,并将它们与实验兔的降压反应结果进行比较分析。

1.4.3 灵敏度符合要求的判定依据:《中国药典》(2015年版)中“1145降压物质检查法”要求进行降压物质检查时,要先进行实验动物的灵敏度检查试验,即自静脉依次注入组胺对照品溶液,剂量分别为0.05μg/kg、0.1μg/kg和 0.15μg/kg,重复 2～3次,如 0.1μg/kg组胺所致的血压下降值均不小于2.67 kPa,同时各剂量所致反应的均值有差别,方可认为该动物的灵敏度符合要求。

1.5 统计方法

先利用RM 6280C系列多道生L信号采集处L系统软件对采集图谱计算血压的下降值,再采用SPSS 19.0软件进行统计分析,计量资料以平均值±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 3种实验兔对组胺和生脉注射液降压试验的比较

2.1.1 3种实验兔基础血压比较:3个不同品种实验兔基础血压值有一定的差异,新西兰兔基础血压值与日本大耳白兔、青紫蓝兔相比,均无统计学差异,但日本大耳白兔的基础血压值显著大于青紫蓝兔的基础血压值(P<0.05),见表1。

表1 3个不同品种实验兔之间基础血压值及其均值的比较Table 1 Comparison of basic blood pressure values and its mean among three different laboratory rabbits

2.1.2 3种实验兔对组胺敏感性的比较:比较不同品种实验兔依次给予0.05μg/kg、0.1μg/kg和0.15μg/kg组胺对照品溶液进行灵敏度试验,每只家兔分别进行 3次,以及按 0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg和5μg/kg给予组胺对照品后的降压程度。结果表明,在 0.05μg/kg～5.0μg/kg的组胺剂量之间,新西兰兔、日本大耳白兔和青紫蓝兔三者之间对组胺的降压反应程度均无统计学差异(P>0.05),见表2。

表2 3个不同品种实验兔对不同剂量组胺降压反应的比较Table 2 Comparison of depressor response of among three different laboratory rabbits to different doses of histamine

2.1.3 3种实验兔对组胺耐受性的比较:3种不同品种实验兔依次给予0.05μg/kg、0.1μg/kg和0.15μg/kg组胺对照品溶液进行灵敏度试验,每只家兔分别进行 3次,以及按 0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg和5μg/kg给予组胺对照品后,动物对组胺的降压反应并没有随着给药剂量和次数的增加而明显降低或无降压反应的现象,且三者之间的降压反应趋势基本一致,说明不同品种实验兔对组胺的耐受性和反应均比较一致,见图1。

2.1.4 3种实验兔血压稳定性的比较:比较了新西兰兔、日本大耳白兔和青紫蓝兔3个不同品种实验兔在组胺降压试验过程中血压的波动性,总体来看,新西兰兔的血压波动相对较少,而其他两个品种,尤其是青紫蓝兔个别动物的血压波动尤为明显,结果见图 2～图 4。

2.1.5 3种实验兔手术操作便利性的比较:新西兰兔、日本大耳白兔均为白色动物,其耳缘静脉血管肉眼清晰可见,便于直接经耳缘静脉注射给药,无需采取颈静脉或股静脉手术操作给药,而青紫蓝兔为灰黑色动物,其耳缘静脉肉眼很难辨别,不便于直接进行静脉注射给药,需采取手术剖离颈静脉进行注射给药,增加手术伤口和费时等。

图1 3个不同品种实验兔对组胺的反应趋势Fig.1 The trend of depressor effects of histamine in three different laboratory rabbits

图2 新西兰兔试验过程中血压波动情况Fig.2 Blood pressure fluctuation in New Zealand rabbit during the experiment

图3 日本大耳白兔试验过程中血压波动情况Fig.3 Blood pressure fluctuation in Japanese white rabbit during the experiment

图4 青紫蓝兔试验过程中血压波动情况Fig.4 Blood pressure fluctuation in the Chinchilla rabbit during the experiment

2.2 实验兔和猫对组胺灵敏度试验结果的比较

2.2.1 实验兔和猫对组胺反应敏感性(降压反应)的比较:结果表明,在0.05～1.0μg/kg组胺剂量范围内,猫的降压反应均显著性大于3种实验兔(P<0.01),相同组胺剂量下猫的降压反应约为实验兔的8倍,见表3。从图5也可知,猫对很小的组胺剂量(0.5μg/kg)的降压反应都远远大于较大剂量的组胺(5μg/kg)对兔的降压作用,说明3种实验兔对组胺的降压反应极不敏感,猫和实验兔对组胺的降压反应存在较大的差异性。

表3 实验兔和猫对不同剂量组胺降压作用的比较Table 3 Comparison of depressor responses of laboratory rabbits and cats to different doses of histamine

图5 不同剂量组胺对实验兔和猫降压作用趋势Fig.5 The trend of depressor effects of different doses of histamine in laboratory rabbits and cats

2.2.2 实验兔和猫对组胺灵敏度试验的比较:由表4和图6可知,所有实验兔对0.05μg/kg、0.1μg/kg和0.15μg/kg组胺剂量的降压反应均值虽有差异但并不明显,且血压下降值均不到1 kPa,远远小于灵敏度试验要求最低的下降值2.67 kPa。即使提高组胺剂量至5μg/kg(约为灵敏度试验剂量0.1μg/kg的50倍),实验兔的降压作用也仅约为1.6 kPa。 而 猫 对 0.05μg/kg、 0.1μg/kg和0.15μg/kg组胺剂量的降压反应均值均大于2.67 kPa,不同剂量间降压均值的差异也较明显。结果表明,实验兔的灵敏度试验是不符合要求的,暂时无法用于降压物质检查。

图6 不同剂量组胺对实验兔和猫降压作用趋势Fig.6 The trend of depressor effects of different doses of histamine in laboratory rabbits and cats

表4 实验兔和猫对不同剂量组胺灵敏度试验结果Table 4 The sensitivity test of laboratory rabbits and cats to different dose of histamine

2.2.3 实验兔和猫对组胺和生脉注射液降压反应的比较:通过分别给予猫和实验兔0.5 m L/kg和1.0 m L/kg的生脉注射液,比较不同动物对生脉注射液的降压反应以及组胺与生脉注射液对猫和实验兔的降压作用。由表5可知,猫对组胺的降压反应约为实验兔的8倍,而对生脉注射液的反应约为实验兔的1.5倍。因此,猫和兔对组胺的敏感性区别很大,但对生脉注射液的降压反应区别不大。兔虽然对组胺的敏感性不高,但对生脉注射液的降压反应却比较敏感,说明组胺对动物的降压作用存在明显的种属选择性和差异性。

表5 实验兔和猫对不同剂量组胺与生脉注射液降压反应值Table 5 The depressor response values of different doses of histamine and Shengmai Injection in laboratory rabbits and cats kPa

3 讨论

目前,临床不良反应中降压休克等类过敏反应较多,可能与包括组胺在内的降压物质有关[3]。来自动植物或微生物发酵提取物及生产过程中有可能混入组胺类或类组胺类物质的原料和注射剂(静脉)应建立降压物质检查项,如抗生素、中药注射剂、氨基酸和多肽类[1,4]。中药含有大量降低血压的未知和已知杂质成分,静脉注射微量该类物质即有急性降血压作用,发生严重的心血管系统不良反应[3]。因此,降压物质检查对控制药品质量、保障用药安全具有重要意义。

现行主要的国内外药典包括中国药典(2015版)、欧洲药典、英国药典、印度药典和国际药典均收载有降压物质检查的方法[2,5-8]。此外,猫由于体循环系统发达,血压稳定,特别是在麻醉状态下,能保持正常血压,血管壁坚韧,耐受麻醉和手术,对药物反应灵敏,较大鼠、家兔等小动物更接近于人体,心搏力强,能描绘出完好的血压曲线等优点[9-10],特别是在神经学、药L学和心血管系统等研究方面,猫具有其他实验动物无法比拟的优势[11]。当前国内外药典收录降压物质检查法也均选择猫作为降压物质检查唯一的实验动物对象。

然而,当前我国未建立实验猫的繁殖、培育和质量检测相关国家标准,实验所用的猫为非标准化实验动物,大多从商贩或收购型饲养场购买,其遗传、年龄、微生物和寄生虫等携带状况不清,个体差异不可控制,健康状况无法保证,对实验结果以及实验人员的健康安全均产生严重的威胁和影响[3,12-16]。 嵇扬等[17]研究表明,按药典规定的组胺剂量,比格犬的血压下降值达不到20 mmHg以上,即比格狗的灵敏度不符合实验要求;而猫的血压下降值均在20 mmHg以上,即猫的灵敏度符合实验要求。猫还对组胺降压作用表现了较好的重现性。目前,尚未发现有利用兔进行降压物质检查的相关研究,因此本研究通过以已标准化的实验兔为研究对象,探索其在降压物质检查中应用的可能性。

本研究结果表明,新西兰兔、日本大耳白兔和青紫蓝兔3种常规实验兔对组胺降压反应的敏感性和耐受性是基本一致的,无品种间的差异性,但新西兰兔的血压相对稳定和操作较便利,认为新西兰兔作为降压试验动物较为L想。此外,还发现3个品种实验兔对《中国药典》规定的组胺剂量(0.05μg/kg、0.1μg/kg和 0.15μg/kg)的降压反应值差异不大且均很低,不到1 kPa,远远小于灵敏度试验要求最低的限值2.67 kPa,其灵敏度试验结果是不符合要求的,也说明了实验兔暂时无法用于降压物质检查。而猫对很小的组胺剂量(0.5μg/kg)的降压反应值均远大于较大剂量的组胺(5μg/kg)对兔的降压作用,说明3种实验兔对组胺的降压反应是极不敏感的,猫和实验兔对组胺的降压反应存在很大的差异。但是通过分别比较猫和实验兔对生脉注射液的降压反应却发现实验兔具有明显的降压反应。在相同给药剂量下,猫对组胺的降压反应约为实验兔的8倍,而对生脉注射液的降压反应仅约为实验兔的1.5倍,说明组胺对动物的降压作用机制存在明显的种属选择性和差异性。其原因可能是由于不同动物参与血压调节的组胺受体作用机制不同[18-19]。其中,猫的H1和H2组胺受体均参与组胺的降压作用,但兔参与降压作用组胺受体存在双向调节作用即只有H2组胺受体参与降压作用而H1是参与升压作用[20-22],具体的原因有待于进一步深入研究。

总之,本研究虽然不能实现将实验兔应用于药品降压物质检查的目标,但却发现组胺对实验兔的降压作用具有明显的动物种属选择性和差异性。此外,实验兔对生脉注射液具有明显的降压反应,可用于一些中药注射剂的降压作用研究。因此,本研究为推动加快实验用猫的实验动物标准化、产业化和降压反应敏感性相关动物模型的构建以及进一步研究组胺对不同动物的降压作用机制的研究均提供了一定的L论基础和参考依据。