非洲绿猴和食蟹猴主要肠道细菌的实时定量PCR检测及分析∗

周小军 尚艳姣 王 进 王 爽 邱业峰

(军事科学院军事医学研究院实验动物中心,北京 100071)

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染会导致获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),具有极高的病死率[1],AIDS的发病机制尚未完全阐明。猴免疫缺陷病毒(sim ian immunodeficiency virus,SIV)与HIV密切同源,SIV天然宿主包括乌白眉猴、非洲绿猴、山魈[2-3]等,研究天然宿主对SIV感染的适应性机制,有助于 AIDS致病机制研究、降低HIV的母婴传播、指导HIV疫苗开发,以及改善对 HIV感染者的长期治疗。

肠道菌群与人体健康密切相关,肠道菌群参与人类的许多生L过程,如宿主代谢、自身免疫和过敏、大脑发育与神经交互等[4-6],此外肠道菌群组成差异还与HIV感染的预防和干预以及抗PD1肿瘤治疗等有效性相关[7-8]。最近一项研究显示,非洲绿猴在SIV感染早期会快速激活并维持其粘膜组织中的再生性伤口愈合机制,提示肠道屏障完整性可能在其对SIV感染适应性中发挥重要作用[9]。本研究拟对非洲绿猴和食蟹猴肠道细菌的相对含量进行比较研究,以明确非洲绿猴肠道菌群特征及其在SIV感染适应过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本中心饲养健康成年非洲绿猴和食蟹猴各12只,排除肥胖个体,普通级,5～8岁[SCXK(军)2012-0019]。每日饲喂全价营养颗粒料,辅以清洁水果,自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 粪便样本采集:每只动物收集其新鲜粪便样本,按每份 200 mg等分后进行液氮速冻,转运至-80℃冰箱保存。

1.2.2 粪便样本 DNA提取:采用 QIAamp PowerFecal DNA Kit进行粪便样本 DNA提取,-80℃冰箱保存。

1.2.3 粪便样本DNA实时定量PCR分析:采用实时定量PCR体系(20μL)包括 10μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix,300 nmol/L正反向引物,300 ng粪便样本DNA,其余用ddH2O补足。实时定量PCR反应条件为:95℃、3 min,95℃、30 s,退火40 s,72℃、30 s,40个循环,72℃、5 min,荧光信号采集设定为80℃、10 s以排除引物二聚体等干扰。针对16 s rDNA区域设计实时定量PCR引物,引物序列和退火温度见表1。

表1 实时定量PCR引物序列和退火温度Table 1 The list of primers and annealing temperatures used in the real-time PCR

图1 非洲绿猴(AGM)和食蟹猴(CM)主要肠道细菌相对含量比较注:横坐标表示动物分组,AGM和CM分别为非洲绿猴组和食蟹猴组;纵坐标表示细菌相对含量Fig.1 Comparsion of the relative abundance of main gut bacteria in AGM and CMNote:The abscissa represents groups while AGM stands for African green money group and CM stands for cynomolgus macaque group;the ordinate represents the relative abundance of main gut bacteria

1.2.4 统计方法:相对定量分析采用 ΔΔCt法,组间相对丰度倍数之间差异性分析采用t检验,P<0.05为显著性差异,统计和作图软件采用GraphPad Prism 5。

2 结果

2.1 非洲绿猴和食蟹猴主要肠道细菌相对含量比较

与食蟹猴相比,非洲绿猴双歧杆菌相对含量显著偏低(比值0.7,P<0.05),乳酸菌相对含量显著偏低(比值0.6,P<0.05),肠杆菌相对含量显著偏低(比值0.5,P<0.05),拟杆菌-普氏菌相对含量显著偏高(比值2.4,P<0.05)。

2.2 非洲绿猴和食蟹猴主要产丁酸盐细菌相对含量比较

与食蟹猴相比,非洲绿猴主要产丁酸盐肠道细菌普拉梭菌相对含量显著偏高(比值3.4,P<0.05),真细菌相对含量显著偏高(比值1.3,P<0.05)。肠道细菌产生短链脂肪酸、涉及代谢通路及产生菌信息见表2。

图2 非洲绿猴(AGM)和食蟹猴(CM)主要产丁酸盐肠道细菌相对含量比较注:横坐标表示动物分组,AGM和CM分别为非洲绿猴组和食蟹猴组;纵坐标表示产丁酸盐细菌相对含量Fig.2 Comparison of the relative abundance of butyrate-producing bacteria in AGM and CMNote:the abscissa represents groups while AGM stands for African green money group and CM stands for cynomolgus macaque group;the ordinate represents the relative abundance of butyrate-producing gut bacteria

表2 短链脂肪酸种类、涉及通路及产生菌信息Table 2 List of short-chain fatty acids,related pathways and producing bacteria

3 讨论

SIV是与HIV-1和HIV-2相对应的灵长类动物免疫缺陷病毒的总称,大量研究表明,SIV在过去几十年中多次跨越种属屏障传播给人,在人群中进化、分化为具有不同流行和致病特征的各种HIV毒株[10]。SIV利用 CD4分子作为受体,以及 CCR5,CXCR4或者CCR2之一作为共受体感染非人灵长类动物[11-13]。SIV感染导致猕猴等非天然宿主引发AIDS,却不会在天然宿主中造成进展性疾病。SIV天然宿主具有许多共性免疫学特征,其中T细胞上CD4表达的下调在包括非洲绿猴在内的一些SIV天然宿主中表现为进化上的保守性[14]。一项新近研究比较了恒河猴和非洲绿猴在SIV急性感染期肠道组织表达谱差异,发现非洲绿猴在SIV感染早期会快速激活并维持其黏膜组织中的再生性伤口愈合机制,也提示肠道屏障完整性可能在其对SIV感染适应性中发挥重要作用[9]。

研究非人灵长类动物肠道菌群具有一定的转化医学价值,早期和慢性期HIV感染病人的肠道菌群组成发生明显改变[15],猕猴等非人灵长类动物在SIV感染早期的肠道炎症反应与肠道菌群变化与HIV急性感染病人相似[16],而SIV感染慢性期非人灵长类动物肠道菌群组成变化趋势与HIV慢性期病人符合性相对较低[17]。

非人灵长类动物肠道菌群组成以及各菌门间的优势趋势与多数其他哺乳动物相似[18],不同非人灵长类动物的肠道菌群组成在科和属水平上的相似度要比门水平低得多。研究表明,非人灵长类动物肠道菌群组成不仅具有宿主物种特异性,而且在很大程度上能反映宿主的系统发育关系[19-21]。尽管食性(肉食性、植食性、杂食性)影响非人灵长类肠道菌群组成,一项对18种野生非人灵长类动物肠道菌群的比较研究显示,宿主饮食生态位对灵长类菌群组成和功能的影响微弱,宿主系统发育和生L影响更大[22]。非洲绿猴在自发性高血压、脂质代谢以及对SIV感染的致病性方面等具有显著不同于食蟹猴的生物学特性[23-24],提示非洲绿猴和食蟹猴在肠道菌群组成上可能具有特征性差异。

本研究结果显示,与食蟹猴相比,非洲绿猴双歧杆菌、乳酸菌以及肠杆菌相对含量显著偏低(P<0.05),而普氏菌以及丁酸盐产生菌——普拉梭菌和真细菌相对含量更高(P<0.05)。肠道菌群与代谢和肠道稳态密切相关,肠道菌群的代谢产物短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs),如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐,影响肠道免疫细胞稳态[25],其中丁酸盐通过对肠道表皮细胞和免疫细胞发挥抗炎效果,进而影响肠道稳态和健康[26]。产丁酸盐的细菌包括灵巧粪球菌、直肠真杆菌、霍氏真杆菌、普拉梭菌、罗氏菌等[27]。研究显示,在 SIV急性感染猕猴以及HIV慢性感染病人中,普氏菌相对含量显著上升,而乳酸菌相对含量显著下降[28-32],与本研究中非洲绿猴特征相似。另外,非洲绿猴产丁酸盐的细菌相对含量更高,反映出其肠道免疫细胞稳态和黏膜完整性具有不同于食蟹猴的进化适应特征,这可能是非洲绿猴作为SIV天然宿主长期自然进化选择的结果,也为深入研究非洲绿猴的肠道菌群与代谢的相互作用及其对SIV感染进化适应的相关机制奠定了基础。