慢病毒介导Gag-caspase-8对小鼠乳腺癌细胞移植瘤的抑制作用*

程宇凌 孙方正 敖竹君 陈 伟△ 张 瑞

（遵义医科大学，1 附属贵州省儿童医院，2 人体解剖学与组织学胚胎学教研室，遵义 563000； 3 毕节医学高等专科学校，毕节 551603）

Caspase-8 可通过激活凋亡途径促进乳腺癌的凋亡[1]。慢病毒载体（lentiviral vector，LV）是以HIV-1 病毒（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础演变而来的一种基因治疗载体，具有转染效率更高、外源基因可在宿主细胞内稳定存在和避免宿主细胞对外源基因的切割修饰等优点。本课题组前期研究证实，Gag-caspase-8 能抑制乳腺癌4T1 细胞的增殖[2]。本研究将构建小鼠乳腺癌荷瘤模型，用携带Gagcaspase-8 的重组慢病毒载体转染小鼠乳腺癌荷瘤，通过瘤内给药，观察各组荷瘤小鼠的一般情况及肿瘤生长状况，并检测移植瘤caspase-8 蛋白表达情况，旨在为以caspase-8 为靶点的乳腺癌治疗提供进一步的动物实验研究依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株、实验动物与主要试剂

4T1 细胞株购买自中国医学科学院。BALB/C小鼠15 只，雌性，5 ～6 周龄，体质量17 ～20 g，购自陆军军医大学实验动物中心，许可证号SCXK（渝）2012-0005。3 种质粒（Δ8.2、VSVG、Gagcaspase-8）及PEI 转染试剂由加拿大曼尼托巴大学敖竹君博士提供；本教研室进行慢病毒包装，DMEM 培养基（高糖）购自美国Hyclone 公司；免疫荧光一抗与二抗稀释液购于北京博奥森生物技术公司：兔抗鼠购于英国Abcam 公司，

1.2 慢病毒载体的转染

用含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 U/L 链霉素的高糖DMEM 培养基培养293T 细胞，置37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，每3 d 换液1 次，待细胞密度增至80%～90%融合时，消化293T 细胞，并接种于培养皿中，每皿接种约2×105个细胞，铺皿24 h 后进行病毒包装，转染48 h 后，收集病毒颗粒。

1.3 小鼠造模及抑瘤实验

4T1 乳腺癌细胞用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基培养，置于37℃、5%的CO2培养箱中无菌培养。将生长状况良好的15 只小鼠饲养5 d 后，将状态良好的4T1 细胞消化成单细胞悬液，将0.1 mL（l×107/mL 细胞） 4T1 细胞接种入小鼠右侧第二乳腺脂肪垫部。从种植第10 天开始测量肿瘤体积大小，每3 d 测量1 次，直至处死小鼠，并记录数据，用游标卡尺测量肿瘤最长径（a）及其垂直方向最大横径（b），计算公式V（ mm3）=a×b2/2。第10 天成瘤后将小鼠随机分为对照组（注射等量PBS）、Gag-caspase-8 治疗组（注射1×106/mL Gag-caspase-8）和Gag 组（注射1×106/mL Gag），给药为瘤内注射，每只小鼠每次0.1 mL，每3 d 重复给药1 次，共计3 次。每日观察小鼠饮食、精神、活动状况及肿瘤生长情况。给药12 d 后，采用脱颈法处死小鼠，无菌超净台中摘取乳腺癌瘤体及小鼠肺组织，液氮迅速冰冻， -80℃冰箱保存，待进行后续试验。从种瘤第10 天（抑瘤第1 天）开始，每3 d 定时用游标卡尺测量荷瘤的体积大小，并作记录，实验结束时，测得最大抑瘤率。抑瘤率（%）=（1-实验组平均瘤体积/对照组平均瘤体积）×100%。

1.4 免疫荧光检测荷瘤中caspase-8 的表达

切片经山羊血清封闭，滴加一抗（1∶100），4℃孵育过夜，滴加二抗羊抗小鼠（2 mg/mL），37℃孵育1 h，PBS 洗涤，滴加抗体，37 ℃孵育1 h，PBS 洗涤，室温避光孵育Hoechst 15 min，荧光显微镜观察。

1.5 小鼠移植瘤及肺转移瘤组织切片制备及H-E 染色

瘤体置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，双蒸水冲洗24 h，再经过脱水、透明、浸蜡、包埋，切片后常规行H-E 染色，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.6 统计学处理

采用SPSS19.0 软件对数据进行统计学处理，组间数据比较采用单因素方差分析，肺转移结节数据采用GraphPad Prism 5 软件进行统计分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Gag-caspase-8 抑制荷瘤生长

接种小鼠乳腺癌4T1 细胞10 d 后，皮下种植部位均出现结节，成瘤率达到100%。小鼠移植瘤的体积变化见图1。随着治疗时间延长，抑瘤效果越来越明显，抑瘤第12 天（种瘤第22 天），Gagcaspase-8 治疗组移植瘤体积明显小于对照组和Gag组[（286.74±112.23）mm3比（671.51±221.93）mm3、（753.06±197.09）mm3，P＜0.01]，Gagcaspase-8 治疗组抑瘤率明显高于对照组、Gag组（55.34%比6%、0.00%，P＜0.05）（图1）。

2.2 Caspase-8 蛋白在荷瘤体内高表达

免疫荧光法检测结果显示，Gag-caspase-8 组caspase-8 蛋白表达明显高于对照组、Gag 组（图2）。

2.3 Gag-caspase-8 慢病毒颗粒对荷瘤肺转移的影响

大体解剖观察，对照组小鼠肺表面可见多个大小不等肿瘤转移结节，质硬；Gag-caspase-8 治疗组未见转移肺结节；镜下见对照组转移灶内正常肺泡结构消失，肺组织实变，乳腺癌样细胞排列紧密、紊乱，呈推挤性方式生长；Gag-caspase-8 治疗组肺组织结构正常，未见转移灶（图3）。

图1 Gag-caspase-8 慢病毒颗粒抑制荷瘤的生长。A：第0 天将4T1 细胞接种入小鼠右侧第二乳腺脂肪垫部，分别于第10 天、第13 天、第16 天将Gag-caspase-8、Gag 及 PBS 进行瘤内注射，于第22 天处死小鼠；B：游标卡尺测量Gag-caspase-8 组、Gag 组及对照组瘤体直径；C：Gag-caspase-8 组、Gag 组及对照组瘤体体积变化过程；D：Gag-caspase-8 组、Gag 组及对照组瘤体质量（*P＜0.05 vs control；△P＜0.05 vs Gag）.图2 Caspase-8 在Gag-caspase-8 慢病毒颗粒组荷瘤体内高表达。A：Gag-caspase-8 组；B：Gag 组；C：对照组；A1 ～C1：DAPI；A2 ～C2：Caspase-8；A3 ～C3：合并。 荧光显微镜见细胞质内caspase-8 蛋白呈红色荧光.图3 Gag-caspase-8 慢病毒颗粒对荷瘤肺转移的影响。A：Gag-caspase-8 治疗组未见肿瘤转移结节；B：对照组小鼠大体解剖观察肺表面可见多个大小不等肿瘤转移结节，质硬（箭头）；C：对照组与Gag-caspase-8 组肺转移结节比较（*P＜0.05）；D：对照组见转移灶，镜下见转移灶内正常肺泡结构消失，肺组织实变，乳腺癌样细胞排列紧密、紊乱，呈推挤性方式生长，H-E 染色；E：为D 图高倍视野；F：Gag-caspase-8 组肺组织结构正常，未见转移灶；G：为F 图高倍视野.Fig 1 Inhibitory effect of Gag-caspase-8 on the growth of mice breast cancer ：In vivo Gag-caspase-8 treatment inhibited mouse breast cancer progress. A： Summary of the experiment：The cells were inoculated into the right mammary fat pad of the 6-week-old female BALB/c mice at day 0. Gag-caspase-8， Gag， or PBS were injected to the center of the tumor mass at day 10， 13， and 16. The mice were sacrificed at day 22； B： Measure the tumor diameter of Gag-caspase-8， Gag and control groups by cursor caliper； C： Mean tumor progression of mice receiving Gag-caspase-8 group， Gag group， or control group； D： Weight of tumor in each group（*P＜0.05 vs control； △P＜0.05 vs Gag）.Fig 2 Representative photomicrographs of DAPI （A1-C1）， caspase-8（A2-B2） and merge（A3-C3） labeling tumor. A：Gag-caspase group；B：Gag group；C：Control group.Fig 3 Effects of Gag-caspase-8 on lung metastasis in breast cancer 4T1 cells in mice. A：Tumor metastasis nodules were not found in treatment group；B： Several hard tumor metastasis nodules of different sizes were observed in the lung surface of control group； C：Comparison of metastatic nodules in the lungs between control group and LV- Gag-caspase-8 group（P＜0.05）. H-E staining of model mice lung； D （low power field） and E（high power field）： Under the microscope， normal alveolar structure disappeared in the metastasis， lung tissue was solid， breast cancer like cells were closely arranged and disordered， and they grew in a pushing manner in control group； F （low power field） and G（high power field）： The lung tissue structure was normal without metastasis in the Gag-caspase-8 group.

3 讨论

国内外研究显示caspase-8 在乳腺癌肿瘤中低表达，且与组织学分级及肿瘤大小密切相关，caspase-8 可能参与了乳腺癌的发生及进展[3-4]。目前国内外尚无慢病毒介导外源性caspase-8 诱导乳腺癌细胞凋亡的报道，因此本课题利用可感染分裂期与非分裂期细胞的慢病毒颗粒作为载体，将外源性caspase-8 导入小鼠乳腺癌4T1 细胞，抑制了乳腺癌瘤体的生长，外源性caspase-8 表达明显增高。因此推测慢病毒载体可作为caspase-8 基因的一种可靠运载工具，Gag-caspase-8 慢病毒颗粒可有效将外源性caspase-8 导入乳腺癌4T1 细胞内，激活细胞凋亡的死亡受体途径，caspase-8 通过酶切活化后经异源活化方式激活下游的凋亡蛋白，促进乳腺癌4T1 细胞的凋亡，达到抑制乳腺癌瘤体生长的目的，为寻找特异性抑制三阴性乳腺癌靶向临床治疗提供有效的参考依据。

乳腺癌是一种易发生多器官转移的恶性肿瘤，常易转移至肺，其次是肝和骨[5-6]。本实验利用4T1 乳腺癌小鼠模型，Gag-caspase-8 慢病毒颗粒注射到小鼠瘤体内，观察小鼠移植瘤的生长情况，并利用免疫荧光方法检测caspase-8 的含量，结果显示转染组移植瘤生长受到明显抑制，最大抑瘤率为55.34%，移植瘤体积较对照组和Gag 组明显缩小；Gag-caspase-8 组caspase-8 蛋白的表达量明显高于对照组，而Gag 组与对照组相比较基本无显著变化；对照组小鼠较Gag-caspase-8 组相比发生了明显的肺转移结节，表明Gag-caspase-8 对4T1 细胞乳腺癌小鼠肺转移具有一定的抑制作用。

本课题组前期通过体外实验研究表明，Gagcaspase-8 能降低4T1 乳腺癌细胞的增殖能力，使之成为肿瘤治疗的一个潜在靶点。综上所述，caspase-8 通过慢病毒介导可靶向转导至小鼠乳腺癌移植瘤，并且可以抑制肺转移和在肿瘤部位发挥抑瘤作用，增加caspase-8 的表达，为以Gagcaspase-8 为靶点的新药开发提供方法及相应的实验支持，并为随后的治疗方法研究提供方向。