厌氧氨氧化反应器启动过程的影响因素及微生物群落变化研究进展

任 婧， 徐爱玲, 宋志文

(青岛理工大学 环境与市政工程学院，山东 青岛 266033)

当前，水体氮素污染日益严重，极大地影响到环境和人体健康，采用常规硝化和异养反硝化脱氮工艺通常需要曝气和外加有机碳源，并且产泥量多。厌氧氨氧化(Anaerobic Ammonium Oxidation, ANAMMOX)是新兴的高效生物脱氮技术，对于填埋厂渗滤液、污泥消化池上清液及其他含高氨氮、低碳氮比废水有较高的处理能力，是一种有效的处理方式[1]。1995年，van de Graaf等[2]在荷兰某酵母生产企业污水处理系统中发现厌氧氨氧化菌的存在并提出了厌氧氨氧化菌代谢模型(图1)，即亚硝酸盐被亚硝酸盐还原酶还原为羟胺(NH2OH)，联氨水解酶催化羟胺和氨缩合成联氨(N2H2)，最后，联氨在联氨氧化酶HZO(或羟胺氧化还原酶HAO)的催化下转化成氮气，同时释放的电子通过传递链传递给亚硝酸盐还原酶。厌氧氨氧化菌(Anaerobic ammonia oxidation bacteria, AnAOB)俗称为“红菌”，因富集培养物呈现红色颗粒状而得其名。Anammox菌对环境适应性强，在污水处理厂活性污泥、海洋、淡水湖和河底土壤生态系统中普遍存在，甚至在北极海底冰川中能够存活，这为厌氧氨氧化菌的实际应用提供了新的思路。然而，研究显示此类微生物在最佳生长条件下代时约为10～12 d，Anammox缓慢地生长速率使其在污水处理系统中具有较低的污泥产量，导致启动时间过长，通常情况下，启动时间可能长达几个月到几年[3]，由此限制了其在废水处理系统中的应用[4]，因此探讨快速有效的Anammox富集培养方法对厌氧氨氧化技术的推广至关重要。本文综述了国内外厌氧氨氧化反应器启动过程的影响因素及微生物群落变化的最新研究进展，并对该技术今后的研究方向提出了建议，期望对厌氧氨氧化领域的后续研究提供参考。

图1 基于15N示踪研究的代谢途径Fig.1 Metabolic pathway based on 15N tracer study

1 厌氧氨氧化机理

反应可以看成由两个过程组成：①分解(产能)代谢：以氨为电子供体，亚硝酸盐为电子受体，两者以1∶1的比例反应生成氮气，并把产生的能量以ATP形式储存起来；②合成代谢：以亚硝酸盐为电子受体提供还原力，利用二氧化碳为碳源，以分解代谢产生的ATP为能源合成细胞物质，并在该过程中产生硝酸盐[5]。

2 Anammox菌富集培养装置

上流式厌氧污泥床(Up-flow anaerobic sludge blanket reactor, UASB)是目前最受欢迎的用于废水厌氧生物处理反应器，由lettinga等在20世纪70年代开发[6]。与传统的厌氧处理相比，UASB反应器的优势在于污泥持留量高、容积负荷高，反应器可以在较短的水力停留时间下运行。

UASB反应器通常由四个部分组成：①颗粒污泥床；②流化区；③气固分离器；④沉降室。UASB反应器装置构造见图2。

图2 UASB系统装置图Fig.2 Schematic diagram of the UASB system

3 影响厌氧氨氧化反应的因素

3.1 温度

温度会影响微生物的活性，厌氧氨氧化细菌对温度条件要求很高，并且不同种类的厌氧氨氧化细菌对温度要求不同[7]。De等[8]研究了温度降低(从35 ℃降至20 ℃)对厌氧氨氧化序批式反应器(SBR)脱氮性能和微生物群落结构及多样性的影响。结果表明，氨氮和亚硝态氮的平均去除率在富集期的第一阶段(35 ℃)和第二阶段(25 ℃)较高(96%)，在20 ℃运行时略有下降(90%)。同时，温度降低会改变微生物群落结构和多样性。当反应器温度从35 ℃降至20 ℃时Chloroflexi(绿弯菌门)的相对丰度从36%降至16%，由于该门细菌大多数嗜热，低温会导致细菌活性和代谢降低。此外，在具有厌氧氨氧化活性的反应器中，Chloroflexi利用的碳源主要来自细胞裂解，低温条件下细胞衰减率可能会降低，因此限制了Chloroflexi的生长。Li等[9]研究了厌氧氨氧化序批式反应器(SBR)在较低氮负荷率(NLR)(0.28 kgN/(m3/d))时，不同温度下的脱氮性能和微生物群落结构变化。结果表明，当温度从(33±1) ℃下降到(15±1) ℃时，脱氮性能明显下降(P<0.05)，出水氮化合物急剧增加，NVLR容量从(0.70 ± 0.05) mgN/(L·h)降至(0.55 ±0.08) mgN/(L·h)，说明在较低温度下Anammox活性受到抑制，Gonzalez-Martinez等[10]利用亚硝酸盐(CANON)生物反应器通过降温(从35 ℃到15 ℃)处理厌氧消化物，并通过降低氨浓度(从466 mgN/L降至100 mgN/L)观察反应器除氮性能，表明在低温下氮去除性能明显下降。但也有研究发现，不同环境下Anammox菌有不同的适宜温度，在格陵兰岛的海洋沉积物中，Anammox的最适温度为12 ℃[11]。说明海洋厌氧氨氧化菌适宜的温度范围比污水厂低得多，可以在较低温度下处理含海水污水[12]。

3.2 溶解氧

Anammox菌是厌氧微生物，对溶解氧非常敏感，溶解氧过高对厌氧氨氧化活性有抑制作用，但该抑制过程是可逆的[13]。Carvajal-Arroyo等[14]研究DO含量为(1.0～8.0) mg/L时厌氧氨氧化反应器的处理效果，发现在DO为8.0 mg/L时，Anammox菌活性严重抑制，在DO为1.0 mg/L时，仅观察到20%以下的部分Anammox菌活性受到抑制，而Anammox菌在低水平的溶解氧下可以保持相当大的活性。溶解氧抑制作用的强弱与富集期间使用的反应器类型有关。在UASB反应器中，溶解氧浓度为0.30 mg/L对厌氧氨氧化活性没有明显影响，Jetten等[15]利用SBR反应器研究了氧气对Anammox过程的影响，控制DO浓度从2%逐渐降低到0，实验结果表明，在0.5%、1%和2%DO条件下，氨氮没有被氧化。向反应器内通入氩气除去所有空气后，氨氮和亚硝酸氮的转化才得以恢复，说明SBR反应器内的Anammox菌只有在严格厌氧条件下才能保持稳定的活性。Wang等[16]使用不含氨和亚硝酸盐的合成废水洗涤Anammox污泥直至检测不到氨和亚硝酸盐，将Anammox污泥等量转移到2个“饥饿”反应器(即滴加式半间歇反应器)中进行批量实验，通过氨去除率、活/死菌染色和荧光原位杂交实验研究了经过84 d饥饿胁迫期间Anammox菌的活性变化，Anammox菌的厌氧和好氧衰变率分别为(0.015± 0.001) /d和(0.028± 0.001) /d，表明与厌氧饥饿条件相比，Anammox菌在有氧饥饿条件下会更快地失去活性。Kalvelage等[17]研究发现，Anammox菌对溶解氧适应的浓度上限为20 μmol/L，也有文献报道在Anammox反应器中最高DO浓度为1.5 mg/L。

3.3 pH

3.4 盐度

Anammox菌活性和反应器除氮性能受盐度影响很大。当废水中含盐量过高时，会破坏Anammox菌细胞膜和胞内酶，对菌体生长产生抑制作用。Dapena-Mora等[22]发现当盐度添加到20 g/L时SAA值(厌氧氨氧化活性)会降低，低盐度对Anammox菌活性有利，淡水厌氧氨氧化菌在盐度为10 g/L时具有最大厌氧氨氧化率。Meng等[23]研究了盐度变化对厌氧氨氧化细菌功能蛋白的影响，结果表明，反应器内盐度从0 g/L增加到20 g/L，导致厌氧氨氧化反应器脱氮性能下降，有18种蛋白质含量降低，血红蛋白(I3IPU4)和血红素合成蛋白(I3IL00)急剧减少，说明在高盐度下Anammox菌活性受到抑制。Jiang等[24]在盐度梯度(0%～40%)下进行了连续培养实验，研究了长江口潮间湿地厌氧氨氧化菌活性、多样性和丰度对盐度变化的响应，结果表明，对Anammox进行长期培养(120 d)，当盐度为5 g/L时，表现出最大的厌氧氨氧化细菌的活性和丰度，在短时间内(10 d)当盐度介于(0～20) g/L之间时，Anammox菌活性和丰度会随盐度的增加而增加，但当盐度增加到30 g/L，其活性明显减弱，与Engelbrecht等[25]研究结果一致。此外，盐度的长期影响比短期影响更明显，盐度的急剧变化比盐度逐渐增加对Anammox菌的影响更大，Yang等[26]发现盐度从14 g/L急剧增加到20 g/L时，厌氧氨氧化反应器性能完全抑制。Anammox菌对高盐度敏感是阻碍厌氧氨氧化工艺在含氮废水处理中应用的关键因素，目前关于经过高盐度抑制后的厌氧氨氧化过程性能恢复的研究还比较少。

3.5 抗生素

污水处理过程中抗生素的出现与积累越来越受到关注，国内外已有大量关于抗生素对厌氧氨氧化反应影响的研究报道。抗生素对厌氧氨氧化菌的影响可分为短期抑制和长期抑制，其中青霉素G和土霉素对厌氧氨氧化菌活性的长期抑制远远大于短期抑制。马静等[27]通过考察青霉素、土霉素和硫酸多粘菌素对厌氧氨氧化颗粒污泥活性的短期抑制特性，结果表明，硫酸多粘菌素对厌氧氨氧化颗粒污泥的活性抑制作用最强，其次是土霉素和青霉素，厌氧氨氧化颗粒污泥对3种抗生素具有较好的耐受能力。多粘菌素对Anammox菌的活性抑制作用强的原因可能是多粘菌素为多肽类抗生素，能杀死大多数革兰阴性菌。Zhang等[28]研究了两种抗生素(诺氟沙星(NOR)和红霉素(ERY))对Anammox菌生物膜的长期影响，表明NOR不仅会降低Anammox的活性，还会降低其功能性OTU丰度，而向Anammox系统中添加ERY，可以诱导细菌体内ermB和mphA两个基因的扩增，其中ermB具有抵抗ERY的作用，mphA可以使ERY失活，因此Anammox菌的活性和功能性OUT没有明显变化。

3.6 污泥来源

选择合适的接种污泥或菌剂作为接种物是快速启动厌氧氨氧化反应器的关键。研究发现，Anammox菌适宜生存在同时有氨盐和亚硝酸盐的环境中。这种环境通常存在于好氧-厌氧环境中沉积物或水体的界面。目前，不同类型的污泥已被作为用来快速启动厌氧氨氧化反应器的接种物，常见的主要有好氧硝化污泥、厌氧消化污泥、厌氧颗粒污泥、海水底泥以及上述几种的混合污泥。研究发现，在上流式厌氧污泥床(UASB)反应器中接种成熟的厌氧氨氧化物颗粒用于厌氧氨氧化菌富集，在两周内成功富集了厌氧氨氧化细菌，缩短了厌氧氨氧化反应器的启动时间[29]。在有机物耐受方面，颗粒污泥比絮凝污泥更具有优势。反应器在启动过程中通常添加富集的厌氧氨氧化污泥，但这样在含氮废水的处理中具有局限性[30]。为了快速启动厌氧氨氧化反应器，国内外许多研究者对接种污泥的选择进行了大量实验并取得了一定的进展。李莹莹[31]采用厌氧序批式反应器，对5种不同类型的污泥进行厌氧氨氧化反应器的启动，结果如表1所示。接种不同污泥对厌氧氨氧化反应启动存在差别，好氧颗粒污泥未能成功富集Anammox菌，在成功富集出的4种污泥中，污泥源中C/N越低，反应器启动时间越短，与Sheng等[32]研究的结果相似，当C/N比增加时，Anammox菌丰度会相对减少。高氮厌氧污泥启动时间最短，但在实际应用过程中较难获得，而混合污泥较为广泛，可作为富集Anammox菌的泥源。

4 厌氧氨氧化接种物选择的分子鉴定

由于厌氧氨氧化细菌生长速度极为缓慢，目前仍没有成功分离出其纯菌种，因此分子技术成为用于鉴定Anammox菌最广泛的方法。利用PCR方法对各种污泥中的厌氧氨氧化细菌进行鉴定，具有快速、操作简单、价格低廉等优点。表2中列举了用于厌氧氨氧化菌鉴定使用的引物序列。

5 厌氧氨氧化反应器启动过程中群落结构特征

到目前为止，研究发现的厌氧氨氧化菌共有7个属：Kuenenia、Brocadia、Anammoxoglobus、Brasilis、Jettenia、Scalindua、Anammoximicrobium；20个种[40]。表3中列举了目前已发现的厌氧氨氧化菌。其中大多数来自污水处理系统中的活性污泥，还有一部分来自海洋与河流沉积物。

表1 不同接种污泥对厌氧氨氧化反应器启动的影响[30]

Table 1 Influence of different inoculation sludge on start-up of anammox reactor[30]

表2 用于厌氧氨氧化菌鉴定的16S rRNA基因PCR扩增引物

注：a表示实时定量荧光PCR

表3 目前已发现的厌氧氨氧化菌

杨瑞丽等[60]对启动成功Anammox工艺中的污泥样品进行群落结构分析，于浮霉菌门中检测到4个Anammox菌属：CandidatusJettenia、Ca.Kuenenia、Ca.Brocadia和Ca.Anammoximicrobium属，占测序总数的1.65%，Ca.Jettenia和Ca.Kuenenia是反应器中主要的Anammox菌属。谭锡诚等[61]分析了UASB系统中微生物群落结构变化，结果表明，厌氧氨氧化优势菌种由Ca.Brocadia(20 d)变为Ca.Jettenia和Ca.Kuenenia的混合菌种(134 d)。姚芳等[62]分别接种城市污水处理厂活性污泥(A)和厌氧颗粒污泥(B)启动厌氧氨氧化反应器，经过119 d的启动，A反应器中Ca.Brocadia丰度可以达到11.34%，而B反应器中Ca.Brocadia丰度仅为7.28%。汪瑶琪等[63]通过高通量测序法对不同负荷情况下反应器污泥群落结构进行检测，发现绿弯菌门 (Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、WWE3门、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)是优势菌门，其中浮霉菌门中检测出有Ca.Brocadia、Ca.Jettenia、Ca.Kuenenia等，Ca.Brocadia增幅最大，其丰度从0.07% 增至13.40%。Ca.Scalindua属主要分布在海洋环境中，而其他几个属广泛存在于淡水环境中。在Scalindua属中，已经鉴定出两种海洋分子分离物，其中一种，在黑海的缺氧水柱中发现，暂定名为S.sorokinii[38]，另一种在兰德尔峡湾的底泥中被发现[64]。

6 展 望

近年来，同时具备脱氮和能量自给的反应工艺是污水处理的目标，与传统的硝化反硝化相比，厌氧氨氧化工艺具有污泥产量较低、无需曝气、成本低且不产生二次污染的优点。实现反应器快速启动并能够稳定运行是目前厌氧氨氧化技术投入到工程应用的关键，综上所述，选择适宜的温度、溶解氧、pH、盐度、抗生素、接种污泥等进行富集培养，可有效地促进Anammox菌的快速增长，提高富集培养器的启动时间。目前所发现并报道的Anammox菌有7个属、20个种，并广泛分布于各种环境中，可应用于不同来源废水的处理与处置。虽然目前还无法通过传统微生物学的方法对其进行深入研究，但是分子生态学方法的引入使得该领域的研究已经进入了一个崭新的阶段。